فرامرز لالوئی
رضا پورغلام
مژگان بنده پور
مهدی یوسفیان
جواد تقوی
محمود قانعی
محجوبه نیرانی

برای اجرای این پروزه جهت دستیابی به ژن لوسیفراز از باکتری ویبریوفیشری استفاده گردید. برای این منظور باکتری مورد نظراز سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران تهیه گردید. پس ازکشت درمحیط اختصاصی، ‭DNA ‬ژنومی باکتری به روش فنل کلروفرم استخراج شد. جهت تکثیر ژن های ‭LuxA ‬و ‭LuxB ‬از پرایمرهای اختصاصی که جایگاه های هضم آنزیمی ‭KpnI ‬و ‭BamHI ‬درسمت '5 آن تعبیه شده بوده ، استفاده گردید. محصول ‭PCR ‬پس ازخالص سازی درپلاسمید ‭PT‬‮‭257‬‭R ‬کلون گردید و سپس به سلولهای ‭Ecoli ‬منتقل شد. تایید کلون های نوترکیب به روش ‭PCR ‬بارایمرهای اختصاصی و هضم آنزیمی انجام گرفت. پس از تایید، قطعات ‭LuxA ‬و ‭LuxB ‬بترتیب در وکتور بیانی ‭PcDNA‬‮‭1.3‬‭\hug ‬و ‭PcDNA‬‮‭1.3‬‭\neo ‬کلون و جهت تایید آن از واکنش ‭PCR ‬با پرایمرهای اختصاصی و همچنین واکنش هضم آنزیمی استفاده شد. در نهایت پس از تایید، پلاسمیدهای نوترکیب ‭PcDNA‬‮‭1.3‬‭\hug ‬و ‭PcDNA‬‮‭1.3‬‭\neo ‬با استفاده از کیت اختصاصی به سلولهای یوکاریوتی ‭NIH‬3T3 منتقل شدند. جهت بررسی توانایی نورزایی سازه های ژنتیکی تهیه شده، از کشت سلولهای ‭NIH‬3T3 در حضور دکانال (بعنوان سوبسترا ) و غلظت های مختلف آنتی بیوتیک نیومایسین وهیگرومایسین استفاده شد. نتایج نشان داد که پس ازگذشت 2 ساعت ازاضافه شدن سوبسترا، واکنش نورزایی آغاز می شود و بتدریج با رسیدن به زمان 6 ساعت، میزان نورزایی افزایش قابل ملاحظه ای می یابد. علاوه برموارد فوق جهت تایید بیان و تولید پروتیین لوسی فراز، از روش ‭SDS-PAGE ‬و وسترن بلات استفاده شد که ایجاد باند پروتیین ‮‭76‬کیلودالتونی، موید صحت آزمایشات می باشد. کلمات کلیدی: لوسیفراز، فیبریوفیشری، انتقال ژن