حسین جعفری
ندا زند
ابوبکر مرادی

قارچ ‭Verticillium dahliae ‬سهم مهمی ایجاد خسارت در روی محصول زیتون در اغلب مناطق زیتونکاری دنیا به خود اختصاص داده است. برای تشخیص آلودگی درختان زیتون به قارچ ورتیسیلیوم، استفاده از روش های معمول کشت به دلیل قدرت ساپروفیتی ضعیف قارچ و نیز کند رشد بودن آن، وقت گیر بوده و قدرت بالایی برای کشف آلودگی های پنهان را ندارد. استفاده از تکنیک های ملکولی از قبیل روش های مبتنی بر ‭PCR‬، با وجود دقت و حساسیت بالا نیازمند تهیه دستگاه هایی مانند ترموسایکلر می باشد که تهیه آن در همه موارد ممکن نخواهد بود. در دهه اخیر روش شناسایی جدیدی مبتنی بر استفاده از تکثیر قطعاتی از ‭DNA ‬با استفاده از یک بن ماری ساده ارایه شده است که کاربرد آن در بسیاری از ویروس ها و باکتری های انسانی با موفقیت همراه بوده است. در این تحقیق، تکنیک موسوم به ‭LAMP ‬برای تشخیص دقیق، سریع و ارزان قارچ عامل بیماری پژمردگی ورتیسیلیومی مورد ارزیابی گرفت. برای این کار ابتدا نمونه هایی از شاخه درختان زیتون مشکوک به بیماری پژمردگی ورتیسیلیومی از مناطق زیتونکاری طارم در استان زنجان تهیه و در آزمایشگاه نسبت به کشت، جداسازی و شناسایی قارچ عامل بیماری اقدام گردید. سپس ‭DNA ‬ژنومی قارچ با استفاده از سه روش: روش ‭CTAB ‬معمولی، روش سریع استفاده از ‭NaOH‬و روش اصلاح شده استخراج ‭DNA‬از چوب، استخراج شد. بعد از ارزیابی کمی وکیفی ‭DNA ‬استخراج شده، واکنش‭LAMP‬با استفاده از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده برای واکنش ‭LAMP ‬و ‭DNA ‬الگو استخراج شده با سه روش فوق انجام گردید. نتایج نشان داد علی رغم کمیت متفاوت ‭DNA ‬در روش های مختلف استخراج، تکنیک لمپ به دلیل حساسیت بالا توانایی تشخیص حضور پاتوژن در تمام نمونه های آلوده را دارد. به کار گیری روش اصلاح شده استخراج ‭DNA ‬از چوب درختان بیمار، بدون نیاز به کشت و خالص سازی قارچ عامل بیماری، مدت زمان تشخیص آلودگی درختان به قارچ ورتیسیلیوم را به طور چشمگیری کاهش داد. نتایج این تحقیق همچنین نشان داد که تکنیک لمپ حساسیت بیشتری ( حدود ‮‭10‬ برابر) نسبت به تکنیک ‭Nested-PCR ‬در تشخیص اختصاصی قارچ عامل بیماری دارد. از کیت طراحی شده بر مبنای لمپ می توان به طور موثری در غربال گری درختان مادری زیتون در جهت استفاده از مواد گیاهی سالم برای تکثیر استفاده کرد. لغات کلیدی: زیتون، تشخیص ملکولی، ‭LAMP‬، ، پژمردگی ورتیسلیومی، ‭Nested PCR