ایجاد سیستم شناسایی وجود کوفاکتور مولیبدئوم در باکتری Escherichia coli

یکی از آنزیم­های درگیر در تطبیق پذیری با شرایط مختلف محیطی، آنزیم بیوتین سولفوکساید ریداکتاز (BisC) است که علاوه بر توانایی تبدیل بیوتین سولفوکساید به بیوتین در شرایط اکسیداتیو، میتواند متیونین سولفوکساید را نیز به متیونین تبدیل کند. اسید آمینه متیونین چه بصورت آزاد و چه در زنجیره پروتئینی اهمیت بسیاری در فرایند سنتز پروتئین و فعالیت آن داراست. آنزیم بیوتین سولفوکساید ریداکتاز (BisC) برای فعال بودن وابسته به کوفاکتور باکتریایی MGDـBis می­باشد. در این مطالعه به منظور تایید فعال بودن کوفاکتور باکتریایی MGDـBis روشی غیرمستقیم طراحی شد که در این روش از آنزیم باکتریایی بیوتین سولفوکساید (BisC) به عنوان ژن گزارشگر استفاده شد. در این راستا سازه ژنی BisCـpJet ‏ساخته شد و شوک حرارتی به باکتری E.coli استرین Mach1 منتقل شد. کلون­های تشکیل شده در محیط LB جامد با آنتی بیوتیک آمپیسیلین  200 µg/ml انتخاب شدند و سپس واکنش PCR روی آنها صورت گرفت. پس از تایید نتایج توالی یابی کلون­های مثبت، قطعه مورد نظر جدا و به ناقل بیانی pETDuet انتقال داده ­شد. کلون‎های حاوی ژن به باکتری میزبان Rossetta منتقل شدند.  فرابیان آنزیم BisC بر روی ژل PAGEـSDS مورد بررسی قرار گرفت و نیز فعالیت این آنزیم بصورت باند بی‎رنگ بر اثر اکسید شدن متیل وایولوژن روی ژل  Native مشاهده شد که نشان دهنده حضور فعال کوفاکتور MGDـBis بود.

Keywords:

Key words: Bis-MGD , Biotin sulfoxide , Escherichia coli , Molybdenum , Over expression , اشریشیا کلای , بیان بیش از حد , بیس ـ ام جی دی , بیوتین سولفوکساید , مولیبدئوم