شناسایی و بررسی سیلیمارین قارچ اندوفیت جداسازی شده از بذر گیاه خارمریم (Silybum marianum (L) Gaert.)

مقدمه: خارمریم (Silybum marianum (L) Gaert.) از خانواده آستراسه است و سیلیمارین به عنوان ماده موثره با ارزش این گیاه شناخته می شود؛ که در درمان تعدادی از بیماری ها، مانند بیماری های کبدی مورد استفاده قرار می گیرد. چالکون سنتاز یکی از آنزیم های کلیدی در تولید سیلیمارین می باشد. قارچ های اندوفیت بدون ایجاد بیماری، درون بافت گیاه زندگی کرده و تاثیر مفید بر مقدار تولید متابولیت‎های ثانویه گیاهان دارند. اخیرا چندین قارچ اندوفیت از گیاه خارمریم (Silybum marianum (L) Gaert.) جدا شده و مطالعه شیمیایی و مولکولی آنها مورد توجه قرار گرفته است. بنابراین این پژوهش با هدف جداسازی قارچ‎ اندوفیت از بذر گیاه خارمریم، بررسی و مقایسه سیلیمارین تولیدی قارچ و گیاه، همچنین بررسی توالی های آمینواسیدی چالکون سنتاز مربوط به گیاه خارمریم (L Silybum marianum.) و چند گونه قارچ دیگر از پایگاه اطلاعاتی NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) انجام شد. مواد و روش ها: بدین منظور بذرهای خارمریم از محوطه دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری جمع‎آوری و پس از ضدعفونی در محیط MS کشت شدند. پس از ظهور قارچ در محیط، قارچ ها در شرایط استریل به محیط PDA و به منظور خالص سازی، به محیط WA منتقل شدند. جدایه های رشد کرده به محیط PDB منتقل شده و پس از ۱۰ روز استخراج سیلیمارین انجام شد. شناسایی مولکولی جدایه قارچ اندوفیت با تکثیر نواحی ریبوزومی انجام شد، سپس همردیف سازی توالی بدست آمده با توالی های موجود در سایت NCBI با نرم افزار آنلاین BLAST مورد مقایسه قرار گرفتند و با رسم درخت فیلوژنی قارچ اندوفیت شناسایی شد. بررسی بیوانفورماتیکی چالکون سنتاز مربوط به گیاه خارمریم (L. Silybum marianum) و چند گونه قارچ دیگر یا استفاده از پایگاه اطلاعاتی NCBI دامنه‎ها و موقعیت‎های مشابه چالکون سنتاز بدست آمد و با برنامه clustalo پایگاه اطلاعاتی uniprot بررسی شد. سپس با نرم افزارCLC Genomics Workbench۵.۵.۲ مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته و جدول مشخصات آنها رسم گردید. درخت فیلوژنی مربوط به این توالی ها با استفاده از نرم افزار Mega۷ و با روش Neighbor- joining رسم شد. یافته ها: نتایج بدست آمده با دستگاه کروماتوگرافی با کارایی بالا، تولید سیلیمارین از قارچ را نشان داد. مقدار سیلیمارین برای نمونه برگ تهیه شده از گیاه خودرو در محوطه دانشگاه، ppm ۰۷۹/۳۳ و برای گیاه استریل درون شیشه ppm ۱۸۳/۱۷ و برای قارچ اندوفیت ppm ۲۹/۷ اندازه گیری شد. شناسایی مولکولی جدایه های به دست آمده، با استفاده از نواحی ITS انجام و گونه آن،Alternaria alternata شناسایی گردید. همچنین بررسی فیلوژنی چالکون سنتاز به عنوان آنزیم کلیدی برای تولید سیلیمارین بین این گیاه و چند قارچ صورت گرفت؛ که بیشترین نزدیکی را در گیاه S. marianum به قارچ Alternaria sp نشان داد. نتیجه گیری: بررسی تولید سیلیمارین در قارچ جداسازی شده از بذرهای گیاه خارمریم، گیاه درون شیشه ای و فضای باز همراه با مطالعه بیوانفورماتیکی مسیر تولید آنزیم چالکون سنتاز، نقش موثر قارچ های اندوفیتی را در تولید سیلیمارین مشخص کرد. همچنین این جدایه قارچی قادر به تولید سیلیمارین در شرایط آزمایشگاهی بود.

Keywords:

آلترناریا , اندوفیت , سیلیمارین , خارمریم , HPLC