بررسی ساختار و عملکرد آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز انسانی با جایگزینی اسید آمینه آسپارتات با گلیسین در موقعیت ۴۱

سوپر اکسید دیسموتاز (SOD۱) ۱ یک آنزیم آنتی اکسیدان است که جهش در آن باعث ایجاد بیماری اسکلروز جانبی آمیوتروفیک (ALS) میشود. تا کنون بیش از ۱۷۰ جهش در آنزیم SOD۱ با الگوی ارثی ALS گزارش شد که تجمع این پروتئین با ویژگی های پاتولوژیکی این بیماری مرتبط است. در این تحقیق اسید آمینه آسپارتات جایگزین گلیسین (G۴۱D) شد، سپس فعالیت و ساختار آنزیم جهش یافته و آنزیم طبیعی مورد بررسی قرار گرفتند. در این پژوهش از پلاسمید pET-۲۸a(+) که حاوی ژن سوپراکسید دیسموتاز است استفاده شد. با استفاده از نرم افزار Oligo ۷ پرایمرها طراحی و برای ایجاد جهش از روش جهش زایی هدفدار (Quick-change PCR) استفاده شد. محصول تولید شده با استفاده از آنزیم Dpn۱ هضم و سپس با روش شیمیایی به باکتری E. coli DH۵ انتقال داده شد. القای بیان پروتئین تحت تاثیر IPTG و لاکتوز و بررسی آن روی ژل الکتروفورز SDS-PAGE ارزیابی شد. بعد از تخلیص پروتئین با ستون کروماتوگرافی نیکل-سفاروز و دیالیز، فعالیت آنزیم با استفاده از پیروگال ول در طول موج ۴۲۰ نانومتر با روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد. مقایسه ساختاری آنزیم طبیعی و جهش یافته به وسیله ی شدت نشر فلورسانس ذاتی و خارجی در غلظت ۰/۰۲ میلی گرم بر میلی لیتر انجام شد. بیشترین فعالیت ویژه آنزیم طبیعی و جهش یافته ۷۰۳۱ (U/mg) و ۵۷۴۴ (U/mg) به ترتیب محاسبه شد. مطالعات فلورسانس ذاتی نشان داد شدت فلورسانس در آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی افزایش یافته که نشان دهنده قرار گیری اسید آمینه تریپتوفان در محیط غیر قطبی تر میباشد. مطالعات فلورسانس خارجی نشان داد، شدت فلورسانس جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی کاهش پیدا کرده است که بیانگر فشرده تر شدن ساختار و کاهش پاکتهای هیدروفوبیک در سطح میباشد. در نتیجه مشخص شد که این جهش باعث تغییرات موضعی در ساختار آنزیم شده که در نهایت باعث فشردگی آن میشود.