بررسی ایجاد جهش در جایگاه ترئونین ۱۳۷ و تاثیر آن بر روی خصوصیات سوپراکسید دیسموتاز انسانی با استفاده از جهش زایی هدفمند

سوپراکسید دیسموتاز یک دفاع اولیه برای حذف کاتالتیکی آنیون های سوپراکسید عمل می کند. سه نوع آنزیم سوپراکسیددیسموتاز شناخته شده است که SOD۱ سیتوزولی، حاوی مس و روی است. انواع SOD۲ و SOD۳ به ترتیب در میتوکندری و فضای خارج سلولی قرار دارند(.(۱۶ جهش در آنزیم SOD با بیماری های مختلفی همراه است که مهم ترین آن، اسکلروز جانبی آمیوتروفیک خانوادگی (fALS) است . fALS یک بیماری عصبی حرکتی کشنده است که اغلب در اثر جهش در ژن کد کننده آنزیم SOD سیتوزولی به وجود می آید. هدف از این مطالعه بررسی پایداری و ساختاری آنزیم با تغییر اسیدآمینه آب دوست (ترئونین) به اسیدآمینه باردار(آرژنین) در موقعیت ۱۳۷ می باشد. در این تحقیق از پلاسمید pET۲۸a حاوی ژن کد کننده سوپر اکسیددیسموتاز و باکتری E.coli سویه BL۲۱ (DE۳) استفاده شد. جهش زایی به روش Quick-change انجام شد. انتقال پلاسمید به باکتری ، با استفاده از روش شیمیایی (کلسیم کلراید سرد) انجام شد. جهت اطمینان از انتقال پلاسمیدها، باکتری ها روی محیط حاوی آنتی بیوتیک مناسب (کانامایسین) کشت داده شدند. برای اطمینان بیش تر، استخراج پلاسمیدها در حجم کم با استفاده از کیت استخراج پلاسمید صورت گرفت. پس از حصول اطمینان از کیفیت استخراج پلاسمید از طریق بررسی برروی ژل آگارز %۱، نمونه ها جهت تعیین ترادف ارسال شدند. توالی بدست آمده، ردیف نوکلئوتیدی و پروتئینی نمونه های وحشی و جهش یافته باهم مقایسه شدند و جهش تایید گردید. سنجش فعالیت آنزیم با غلظت های مختلف پیروگالل صورت گرفت. بطوری که، بیشترین فعالیت ویژه برای آنزیم طبیعی ۶۲۸۱(U/mg) و برای آنزیم جهش یافته ۶۳۵۲(U/mg) در غلظت ۰,۱ میلی مولار به دست آمده است. نتایج ما نشان داد تغییر اسیدآمینه ترئونین به اسید امینه آرژنین در جایگاه ۱۳۷ سوپراکسید دیسموتاز (T۱۳۷R) ، باعث ایجاد تاخوردگی نامطلوب شده و به عنوان جایگاه مهمی درارتباط با شکل ارثی اسکلروز جانبی آمیوتروفیک می باشد.

Keywords:

سوپر اکسید دیسموتاز انسانی , Quick change-PCR , سنجش فعالیت آنزیم , fALS , جهش T۱۳۷R