کلونینگ ژن GRA۵ توکسوپلاسما گوند ای سویه RH در پلاسمید یوکاریوت

مقدمه: توکسوپلاسموز یکی از بیماری های زئونوز و دارای انتشار وسیع در جهان بوده که اثرات شدید بالینی و دام پزشکی عدیده ای را ایجاد می کند. این انگل داخل سلولی باعث عوارض عصبی و بیماری های چشمی در افراد دارای ضعف ایمنی و نوزادان متولد از مادران آلوده می شود. بروز موارد زیاد بیماری همراه با عوارض شدید و کشنده توکسوپلاسموز ضرورت یافتن واکسن موثری برای این بیماری را نشان می دهد. یکی از مهم ترین راه های کنترل بیماری واکسیناسیون است که تاکنون واکسنی موثر علیه این انگل پیدا نشده است. با عنایت به زئونوز بودن بیماری در جهان، یکی از مهم ترین راه های آلودگی انسان مصرف گوشت های خام یا نیم پز حاوی انگل است. بر همین اساس، استفاده از واکسن مناسب حیوانی نیز می تواند باعث تحریک ایمنی حیوان شده و از آن در مقابل تولید کیست در بدن محافظت نماید. با توجه به شیوع وسیع این انگل داخل سلولی در انسان و حیوانات و اثرات شدید و کشنده آن، تولید واکسن های جدید بر علیه این بیماری ضرورت می یابد. ایمن سازی با پلاسمید حاوی ژن های کدکننده پروتئین های محافظت کننده، به عنوان روشی نسبتا ابداعی و راهکاری امید بخش از تکنیک های ساخت واکسن به شمار می آید. به همین دلیل پلاسمید کدکننده ژن ۵GRA را تهیه تا بتوان از آن برای ساخت واکسن بر علیه این عفونت استفاده نمود. مواد و روش ها: در این تحقیق، ژن GRA۵ با استفاده از روش PCR در پلاسمید انتقالی pTZ۵۷R کلون و پس از آن در باکتری اشرشیاکلی سوش TOP۱۰ ترانسفورم شد. سپس پلاسمید نوترکیب از باکتری میزبان استخراج و ژن هدف با استفاده از آنزیم های Hind۳ و EcoRI از پلاسمید pTZ۵۷Rجدا گردید. در مرحله بعد پلاسمید pcDNA۳ برای پذیرش قطعه GRA۵ و انجام کلونینگ نیز با آنزیم های Hind۳ و EcoRI برش داده شد و ژن GRA۵ درون پلاسمید pcDNA۳ ساب کلون شد. محصول واکنش اتصال در باکتری فوق ترانسفورم و در محیط LB حاوی آمپی سیلین کشت داده شد. پلاسمیدهای نوترکیب pcGRA۵ با استفاده از کیت استخراج پلاسمید، از باکتری تخلیص و در مرحله بعد در سلول یوکاریوتی CHO ترانس فکت گردید و در خاتمه بیان پلاسمید نوترکیب مورد بررسی قرار گرفت. یافته های پژوهش: به منظور تایید مراحل مختلف کار از روش های PCR و برش آنزیمی استفاده شد. پس از الکتروفورز مشخص شد که قطعه GRA۵ در پلاسمید pcDNA۳ کلون شده است. قطعه مورد نظر بر روی ژل الکتروفورز در حدود ۳۶۳ bp بود که هم اندازه ژن GRA۵ توکسوپلاسما گوند ای است. به منظور تایید نهایی، قطعه مورد نظر از تعیین توالی استفاده و با قطعه استاندارد ثبت شده در بانک ژن مقایسه گردید. برای تایید بیان ژن مورد نظر در سلول CHO از روش وسترن بلات استفاده شد. بحث و نتیجه گیری: نتایج نشان داد که کلونینگ و ترانسفورم قطعه GRA۵ در پلاسمید pcDNA۳ با موفقیت انجام شده و با استفاده از روش وسترن بلات بیان پروتئین ۱۳ کیلو دالتونی تایید گردید.

Keywords:

Immunization , GRA۵ , toxoplasma gondaii , cell expressio n , DNA vaccine , توکسوپلاسما گوند ای , کلونینگ , GRA۵ , pcDNA۳ , بیان سلولی , وسترن بلات