استفاده از تکنیکqPCR به منظور شناسایی سویه های کدکننده توکسین کلستریدیوم دیفیسیل

کلستریدیوم دیفیسیل (Clostridium difficile)، باکتری گرم مثبت، بی هوازی و اسپوردار بوده و عامل گاستروآنتریتوکولیت با غشاءکاذب است. هنگامی که میکروفلور طبیعی روده، توسط فاکتورهای خطر، مانند درمان با آنتی بیوتیک ها، شیمی درمانی و غیره آشفته می شود،کلستریدیوم دیفیسیل فرصت تکثیر یافته و باعث بیماری می شود. عوامل اصلی بیماری زایی این باکتری، دوتوکسینB وAهستند،که توسط ژن هایtcdA وtcdB کد می شوند. هدف از این تحقیق توسعه روش qPCR به منظور شناسایی عفونت کلستریدیوم دیفیسیل از طریق طراحی پرایمرهای اختصاصی برای ژن هایtcdAو tcdB می باشد. در این مطالعه ابتدا با بررسی دقیق نواحی حفاظت شده در توالی ژن هایtcdAو tcdB، دو جفت پرایمر برای تکثیر اختصاصی نواحی مورد نظر طراحی شد. سپس بهینه سازی روش qPCRبا استفاده از این پرایمرها انجام شد. حساسیت روش با استفاده از غلظت-های مختلف DNA باکتری مورد ارزیابی قرارگرفت. علاوه براین، به منظور بررسی اختصاصیت روش از DNA باکتری های مولد اسهال (اشرشیاکلی، شیگلا دیسانتری، سالمونلا تیفی و یرسینا انتروگلیتیکا) استفاده شد. در نهایت عملکرد روش بهینه سازی-شده با تعداد ۱۰۰ نمونه بالینی مورد ارزیابی قرارگرفت. حساسیت روش به میزان pg۱۰۰از DNA و اختصاصیت روش بهینه-سازی شده ۱۰۰% تعیین شد. در نمونه های بالینی مورد مطالعه با روش بهینه سازی شده ۹ مورد مثبت شناسایی شد. با توجه به نتایج بدست آمده استفاده از پرایمرهای اختصاصی برای ژن هایtcdA و tcdB می تواند به عنوان رویکرد مناسبی برای شناسایی سریع و دقیق عفونت C. difficile در تکنیک qPCR مورد استفاده قرارگیرد.

Keywords:

کلستریدیوم دیفیسیل , qPCR , توکسین tcdA , توکسین tcdB