آزاده محسنی - Department of crop biotechnology and breeding, Ferdowsi University of Mashhad, Iran
محمد فارسی - Department of crop biotechnology and breeding, Ferdowsi University of Mashhad, Iran
علیرضا سیفی - Department of crop biotechnology and breeding, Ferdowsi University of Mashhad, Iran

اتوفاژی یکی از پاسخ های دفاعی در موجودات مختلف در شرایط تنش و غیرتنش است. در اتوفاژی، ترکیبات و اندامک های آسیب دیده درون وزیکول دو غشایی به نام اتوفاگوزوم قرار می گیرند و به سمت واکوئل هدایت می شوند تا توسط آنزیم های هیدرولیتیکی واکوئل تخریب و به مواد اولیه تجزیه شوند. پروتئین ATG۸ مشخصه مسیر اتوفاژی است که در شکل گیری اتوفاگوزوم و قرارگیری محموله های هدف برای تخریب شدن درون اتوفاگوزوم نقش دارد. در مسیر اتوفاژی انتخابی، حضور پذیرنده محموله برای قرارگیری محموله درون اتوفاگوزوم نقش مهمی ایفا می کند. پذیرنده ها دارای موتیف اتصال به ATG۸ به نام AIM یا LIR هستند که می توانند با دمین LDS که جایگاه اتصال AIM/LIR درATG۸ است، میانکنش دهند. هرگونه تغییر در جایگاه LDS و یا موتیف AIM، سبب برهم خوردن میانکنش ATG۸ و پذیرنده می شود. در تحقیق حاضر، گیاه Marchantia polymorpha با ATG۸B جهش یافته در جایگاه LDS از طریق جهش هدفمند در محل، ایجاد شدند تا برای مطالعات آتی برای شناسایی پذیرنده های احتمالی مورد استفاده قرار گیرند. بدین منظور از طریق بلاست پروتئینی، توالی پروتئین ATG۸B در گیاه مارکانتیا در پایگاه اطلاعاتی Marchantia.info شناسایی شد. از طریق هم ردیفی پروتئین های ATG۸A از گیاه آرابیدوپسیس با ATG۸B گیاه مارکانتیا، اسیدآمینه­هایی که در تاخوردگی ATG۸ و شکل گیری جایگاه LDS نقش دارند، شناسایی شدند. دو آمینواسید لیزین ۵۱ و آرژنین ۷۰، جداگانه با روش جهش هدفمند در محل با آمینواسید آلانین جایگزین شدند. سپس پروتئین فلورسنت GFP با کمک فناوری گرین گیت به پروتئین جهش یافته ATG۸B اتصال یافت. به منظور حفظ شرایط یکسان با گیاهان حاوی ژن ATG۸B وحشی موجود در آزمایشگاه، با طراحی آغازگرهای سازگار با گیت وی، پروتئین های جهش یافته درون سازه بیانی pMpGWB۳۰۳ وارد و پس از انتقال به اگروباکتری سویه GWB۳۰۳+pSOUP به گیاه انتقال داده شد. بررسی گیاهان تراریخته در آزمایشات وسترن بلات نشان داد که تنها فرم تغییر یافته لیزین به آدنین قابلیت بیان شدن و تشکیل پروتئین پایدار را دارد، در حالیکه با تغییر آرژنین به آلانین، پروتئین پایداری خود را از دست داده و قابلیت بیان ندارد.

AIM, Autophagy, Gateway, GreenGate, and LDS, اتوفاژی, گرین گیت, گیت وی, AIM و LDS