شناسایی ژن مربوط به آنزیم P۴۵۰ مسئول تولید آلکالوئید کیلانتیفولین درگیاه Chelidonium majus L. با استفاده از مخمر مهندسی ژنتیک شده Pichia pastoris

گیاهان منشا اصلی تولید متابولیت های ثانویه با ارزش دارویی بالا می باشند. مهمترین عضو این ترکیب های با ارزش، آلکالوئیدها با مصارف مختلف دارویی هستند. با توجه به تولید محدود برخی از این مواد در گیاهان، به عنوان روش جایگزین، با شناسایی و انتقال ژن های مسئول سنتز آنزیم های سازنده آلکالوئیدها از گیاهان به میکروارگانیسم ها می توان به صورت تجاری این گونه از مواد دارویی را به صورت طبیعی تولید کرد. در این راه، شناسایی ژن های مسئول آنزیم های سنتزکننده قدم نخست چنین اقدامی است. در بین آنزیم های سنتزکننده ترکیب های آلکالوئیدی، آنزیم های سیتوکروم P۴۵۰ نقش مهمی دارند. با توجه به وابستگی این آنزیم ها به وجود شبکه اندوپلاسمی و خصوصیات گلیکوپروتئینی این آنزیم ها، نمی توان آنها را در سیستم های باکتریایی استاندارد بیان کرد. بنابراین می توان از میزبان های یوکاریوتی مانند مخمر یا سلول حشرات برای بیان آنها استفاده کرد. در این تحقیق، با استفاده از توالی آمینو اسیدی شناخته شده کیلانتیفولین سنتاز گیاه شقایق کالیفرنیایی و مقایسه فیلوژنی این توالی با توالی های آمینو اسیدی هومولوگ گیاه مامیران بدست آمده از پایگاه داده بیوانفورماتیک، به صورت نظری شش آنزیم سیتوکروم P۴۵۰ با درصد هومولوژی بالا مسئول سنتز آنزیم کیلانتیفولین سنتاز در گیاه مامیران (Chelidonium majaus L.) شناسایی شد. برای اثبات عملی کارآیی این آنزیم ها، ژن های آنها در وکتور pPIC۳.۵ کلون شده و بعد با انتقال این وکتورهای نوترکیب به سلول مخمر Pichia pastoris و در اختیار قرار دادن آلکالوئید اسکولرئین، تولید آلکالوئید کیلانتیفولین توسط میکروب های انتقال ژن داده شده توسط دستگاه LC-MS بررسی گردید. نتایج نشان داد که از بین ژن های کلون و معرفی شده آن آنزیم ها به میزبان مخمر، تنها آنزیم Contig۸۹۳۱ فعالیت کیلانتیفولین سنتازی دارد.

Keywords:

آنزیم های P۴۵۰ , ایزوکینولین آلکالوئید , تولید میکروبی , مخمر