بهینه سازی فرایند رفولدینگ ایمونوتوکسین ضد گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی تولید شده در باکتری اشریشیاکلای

مقدمه: بیان بیش ازحد EGFR با سرطان زایی همراه است و در بیش از ۷۰ درصد سرطان های سر و گردن دیده می شود. بیان ایمونوتوکسین ضد EGFR که به عنوان جایگزینی برای آنتی بادی کامل طراحی شده است، به تولید پروتئین تجمع یافته موسوم به اینکلوژن بادی منجر می گردد. هدف از این مطالعه بررسی دو روش اوره ۸ مولار و گوانیدین هیدروکلراید ۶ مولار برای به دست آوردن ایمونوتوکسین به عنوان فرم محلول و با تاشدگی صحیح بود. مواد و روش ها: سلول های BL۲۱ (DE۳) حاوی وکتور pET۲۸a-huimmunotoxin توسط ۱ میلی مولار IPTG در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ ساعت القا شد و میزان بیان توسط SDS-PAGE بررسی گردید. ایمونوتوکسین به دست آمده که به صورت اینکلوژن بادی بود، جداگانه در اوره ۸ مولار و گوانیدین هیدروکلراید ۶ مولار حل شد و سپس با کروماتوگرافی Ni-NTA خالص گردید که به صورت تک باند در SDS-PAGE دیده شد. برای ریفولد مناسب ایمونوتوکسین به دست آمده، نمونه های حاصل از تخلیص در کیسه دیالیز ریخته و طی یک فرایند چندمرحله ای موسوم به stepwise dialysis، عوامل دناتوره کننده حذف گردیدند. واکنش پذیری ایمونوتوکسین تخلیص شده ریفولدشده توسط تکنیک الایزا با استفاده از لایزت سلولی A۴۳۱ ارزیابی گشت. یافته ها: ایمونوتوکسین به مقدار ۱۷mg/ml توسط باکتری به صورت اینکلوژن بادی بیان شد. ایمونوتوکسین انسانی ریفولدشده با سلول های A۴۳۱ واکنش پذیری بالایی داشت که نشان دهنده تاشدگی مناسب ایمونوتوکسین خالص شده بود. فعالیت اتصالی ۵۰ درصد ایمونوتوکسین انسانی شده به دست آمده از روش های اوره و گوانیدین هیدروکلراید، به ترتیب ۸/۰ و ۷/۱ میکروگرم بر میلی لیتر بود. بحث و نتیجه گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که روش اوره ، روش موثری در محلول سازی و ایجاد فولدینگ مناسب در ایمونوتوکسین هایی است که در باکتری به صورت اینکلوژن بادی تولید می شوند.

Keywords:

Guanidine hydrochloride , Inclusion body , Refolding , Single chain antibody , Urea , اوره , ایمونوتوکسین , اینکلوژن بادی , گوانیدین هیدروکلراید , رفولدینگ