پروین مقدم - گروه علوم سلولی و مولکولی، دانشگاه خوارزمی کرج
آزاده زحمت کش - بخش تحقیق و تولید واکسن های بی هوازی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، کرج
معصومه باقری - موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، کرج
پروانه اسمعیل نژاد اهرنجانی - بخش تحقیق و تولید واکسن های باکتریایی بی هوازی، موسسهی تحقیقات واکسن و سرمسازی رازی، سازمان تحقیقات، ترویج و آموزش کشاورزی، کرج، ایران

هدف: تب برفکی یک بیماری بسیار ویرانگر در حیوانات زوج سم می باشد که خسارات اقتصادی گسترده ای در صنعت دامپروری ایجاد می کند. اخیرا روش های تشخیصی این بیماری برای ردیابی آنتی بادی های علیه پروتئین های غیرساختاری ویروس تب برفکی بسیار توسعه یافته اند. پروتئین های غیرساختاری ۳ABC و ۳D که ارائه دهنده ی اپی توپ های خطی سلول های B هستند، تشخیص موثر دام های آلوده به ویروس را امکان پذیر می کنند. در این تحقیق، اپی توپ های خطی ایمنی زای غالب از پروتئین های ۳ABD برای طراحی ساخت توالی ژنی جدید و اتصال قطعات ۳AB و ۳D در نظر گرفته شد.  مواد و روش ها: از تکنیک گسترش نواحی همپوشان به کمک واکنش زنجیره ای پلیمراز (OE-PCR) برای سنتز توالی ۳ABD آنتی ژنی استفاده شد. RNA ویروسی از سلول های BHK آلوده به ویروس جداسازی و رونویسی معکوس شد. برای حذف توالی میانی ۶۵۴ نوکلئوتیدی ژن۳C ، یک جفت آغازگر داخلی با ۲۹ نوکلئوتید همپوشان و یک جفت آغازگر خارجی طراحی شدند. قطعات ۳AB و ۳D هرکدام در واکنش های جداگانه ی PCR تکثیر شدند و پس از الکتروفورز از ژل تخلیص شدند. این قطعات به عنوان الگو در OE-PCR برای سنتز توالی ۳ABD به کمک آغازگرهای خارجی و آنزیم Pfu پلیمراز در یک واکنش یک مرحله ای مورداستفاده قرار گرفتند. نتایج: نتایج این مطالعه نشان داد که هرکدام از قطعات ۳AB  (۴۱۸ جفت باز) و ۳D  (۵۵۷ جفت باز) با توالی های همپوشان به ترتیب در انتهای '۳ و '۵ تکثیر شدند. OE-PCR منجر به تکثیر چندین قطعه شد و قطعه ی ۳ABD با طول موردنظر (۹۴۶ جفت باز) پس از توالی یابی تایید شد. تنها با در نظر گرفتن ۲۹ جفت باز همولوژی در طراحی آغازگرهای همپوشان و یک آنزیم پلیمراز با دقت بالا، دو ناحیه ی اپی توپی از پروتئین های غیرساختاری ویروس تب برفکی (۳’-۳AB و ۵’-۳D) به هم متصل شدند. نتیجه گیری: توالی ژنی ساخته شده به روش OE-PCR یک مرحله ای، علاوه براین که نواحی آنتی ژنی پروتئین های غیرساختاری ۳ABD ویروس تب برفکی را دارا می باشد، مشکلات مربوط به هزینه ی بالای سنتز پپتید را ندارد و می تواند گزینه ی مناسبی برای تولید پروتئین نوترکیب و بررسی امکان استفاده در تشخیص بیماری تب برفکی به روش الایزا باشد.

آغازگرهای همپوشان, اپی توپ های سلول های B, جهش زایی هدفمند, گسترش نواحی همپوشان