استفاده دومنظوره از دنباله هیدروکسی آپاتیت در پپتید کایمریک PDGF:برای تخلیص و رهایش پپتید

سابقه و هدف: استفاده از دنباله­های تمایلی از روش­های مرسوم برای تخلیص پروتئین­های نوترکیب به شمار می­آید. با این حال حذف آن ها در مراحل بعدی از الزامات پپتید­ها یا پروتئین­های دارویی است که این امر علاوه بر طولانی کردن مسیر تخلیص، هزینه­های زیادی را به تولیدکننده تحمیل می­کند. توالی پپتیدی دارای تمایل اتصال به هیدروکسی آپاتیت، علاوه بر امکان تخلیص پپتید یا پروتئین نوترکیب، موجب اتصال پپتید یا پروتئین­ها به ساختارهای حاوی هیدروکسی آپاتیت مانند دندان، استخوان و حتی گرافت­ های استخوانی می­شود که در بایومتریال، مهندسی بافت،جراحی ها و ایمپلنت های دندان می تواند نقش بسزایی ایفا نماید. هدف از انجام این تحقیق استفاده مناسب از دنباله هایی است که علاوه بر تخلیص پروتئین مورد نظر توسط ستون­های کروماتوگرافی تمایلی، نیازی به حذف دنباله وجود نداشته باشد که از اولویت های بیوتکنولوژی و درمان خواهد بود. مواد و روش ها: در این پروژه، یک فیوژن پپتید مشتق شده از فاکتور رشد پلاکتیPDGF-BB طراحی شد که دارای یک توالی متصل شونده به هیدروکسی آپاتیت و His۶x می­باشد. به منظور حذف توالی هیستیدینی، توالی مورد نظر توسط دو پرایمر حاوی توالی های برشی XhoI و NdeI طراحی و در پایان در وکتور pET۲۱a(+) کلون شد. سپس، واکنش زنجیره پلیمرازی و هضم دوتایی آنزیمی صورت گرفت. فیوژن پپتید مورد نظر در باکتری اشریشیا کلی بیان شد و به روش الکتروفورز SDS-PAGE باند پپتید ملاحظه و در نهایت با وسترن بلات اثبات گردید. برای تخلیص فیوژن پپتید نوترکیب از رزین هیدروکسی آپاتیت استفاده شد. جهت بررسی اتصال پپتید به داربست از تست رهایش استفاده شد که با استفاده از آزمون سنجش پروتئین به روش برادفورد و رسم منحنی ارزیابی گردید. برای بررسی زنده مانی، تکثیر و رشد سلولی تست سمیت سلولی(MTT ASSAY)  انجام شد. یافته ­ها: بیان فیوژن پپتید مورد نظر در باکتری اشریشیا کلی بهینه سازی شد. کلونینگ باکتری اشریشیا کلی در وکتور pET۲۱a(+) بعد از PCR و هضم دوتایی آنزیمی با انجام توالی یابی ژنی، مورد نظر تایید واقع شد. تایید بیان توسط SDS-PAGE و وسترن بلات اثبات گردید. باند پپتید در محدوده وزنی حدود ۱۷ کیلو دالتون مشاهده شد . در آزمون رهایش پپتید مشاهده شد که فیوژن پپتید PDGF-BB قابلیت اتصال پایدار به داربست هیدروکسی آپاتیت را دارد که مانع از آزادسازی کامل پپتید در روز اول در محیطSBF  می شود. در ادامه در روز دوم حدود ۴۰ درصد پپتید رهایش دارد و سپس به پلاتو می رسد . بررسی زنده مانی سلولی با انجام تست MTT نشان داد که سلول ها در طول ۲۴ ساعت تکثیر پیدا کرده و بیشترین رشد سلولی را طی ۲۴ ساعت در غلظت۹/۲میکروگرم بر میلی لیتر نسبت به گروه کنترل داشتند. نتیجه­ گیری: در این پژوهش یک پپتید جدید مشتق شده از PDGF-BB  با عملکرد پایدار طراحی، بیان و با کمک رزین هیدروکسی آپاتیت خالص شد. استفاده دو منظوره از دنباله تمایلی به هیدروکسی آپاتیت می تواند علاوه بر کارایی آن در روند تخلیص با ستون های افینیتی سرامیکی بر پایه هیدروکسی آپاتیت، به عنوان یک فاکتور تمایلی به داربست های استخوانی در مهندسی بافت مورد استفاده قرار گیرد. واژگان کلیدی: هیدروکسی آپاتیت، تخلیص پروتئین، فاکتور رشد پلاکتی، مهندسی بافت ، ترمیم زخم.

Keywords:

Hydroxyl apatite , Protein purification , PDGF-BB , Platelet- derived growth factor , Tissue engineering , Wound healing , ۱.Wood DW. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current opinion in structural biology. ۲۰۱۴ Jun ۱ , ۲۶:۵۴-۶۱. doi.org/۱۰.۱۰۱۶/j.sbi.۲۰۱۴.۰۴.۰۰۶ ۲.Kimple ME , Brill AL , Pasker RL. Overview of affinity tags for protein purification. Current protocols in protein science. ۲۰۱۳ Aug , ۷۳(۱):۹-.doi.org/۱۰.۱۰۰۲/۰۴۷۱۱۴۰۸۶۴.ps۰۹۰۹s۷۳ ۳.Lee JS , Wagoner Johnson AJ , Murphy WL. A modular , hydroxyapatite-binding version of vascular endothelial growth factor. Adv Mater. ۲۰۱۰ Dec ۲۱ , ۲۲(۴۸):۵۴۹۴-۸.doi.org/۱۰.۱۰۰۲/adma.۲۰۱۰۰۲۹۷۰. ۴.Weiger MC , Park JJ , Roy MD , Stafford CM , Karim A , Becker ML. Quantification of the binding affinity of a specific hydroxyapatite binding peptide.Biomaterials.۲۰۱۰ Apr۱ , ۳۱(۱۱):۲۹۵۵-۶۳.doi.org/۱۰.۱۰۱۶/j.biomaterials.۲۰۱۰.۰۱.۰۱۲ ۵.Segvich SJ , Smith HC , Kohn DH. The adsorption of preferential binding peptides to apatite-based materials. Biomaterials. ۲۰۰۹ Mar ۱ , ۳۰(۷):۱۲۸۷-۹۸.doi.org/۱۰.۱۰۱۶/j.biomaterials.۲۰۰۸.۱۱.۰۰۸ ۶.Roy MD , Stanley SK , Amis EJ , Becker ML. Identification of a highly specific hydroxyapatite‐binding peptide using phage display. Advanced Materials. ۲۰۰۸ May ۱۹ , ۲۰(۱۰):۱۸۳۰-۶.doi.org/۱۰.۱۰۰۲/adma.۲۰۰۷۰۲۳۲۲ ۷.Mao J , Shi X , Wu YB , Gong SQ. Identification of specific hydroxyapatite {۰۰۱} binding heptapeptide by phage display and its nucleation effect. Materials. ۲۰۱۶ Aug ۱۷ , ۹(۸):۷۰۰.doi.org/۱۰.۳۳۹۰/ma۹۰۸۰۷۰۰ ۸.Cummings LJ , Snyder MA , Brisack K. Protein chromatography on hydroxyapatite columns. Methods in enzymology. ۲۰۰۹ Jan ۱ , ۴۶۳:۳۸۷-۴۰۴.doi.org/۱۰.۱۰۱۶/S۰۰۷۶-۶۸۷۹(۰۹)۶۳۰۲۴-X ۹.Snyder MA. Working with a powerful and robust mixed-mode resin for protein purification. BioProcess Int. ۲۰۱۱ May , ۹(۵):۵۰-۳. ۱۰.Duanis-Assaf T , Hu T , Lavie M , Zhang Z , Reches M. Understanding the adhesion mechanism of hydroxyapatite-binding peptide. Langmuir. ۲۰۲۲ Jan ۷ , ۳۸(۳):۹۶۸-۷۸.doi.org/۱۰.۱۰۲۱/acs.langmuir.۱c۰۲۲۹۳ ۱۱.Tang W , Becker M. A Hydroxyapatite (HA)-Binding Peptide Functionalized Dendron: Design , Synthesis and application as a Growth Factor Carrier. ۱۲.Bang J , Park H , Yoo J , Lee D , Choi WI , Lee JH , et al. Selection and identification of a novel bone-targeting peptide for biomedical imaging of bone. Scientific reports. ۲۰۲۰ Jun ۲۹ , ۱۰(۱):۱۰۵۷۶. doi.org/۱۰.۱۰۳۸/s۴۱۵۹۸-۰۲۰-۶۷۵۲۲-۴. ۱۳.Huang ZB , Shi X , Mao J , Gong SQ. Design of a hydroxyapatite-binding antimicrobial peptide with improved retention and antibacterial efficacy for oral pathogen control. Scientific Reports. ۲۰۱۶ Dec ۲ , ۶(۱):۱-۱. doi.org/۱۰.۱۰۳۸/srep۳۸۴۱۰ ۱۴.Yuca E , Xie SX , Song L , Boone K , Kamathewatta N , Woolfolk SK , et al. Reconfigurable dual peptide tethered polymer system offers a synergistic solution for next generation dental adhesives. International Journal of Molecular Sciences. ۲۰۲۱ Jun ۱۸ , ۲۲(۱۲):۶۵۵۲.. doi.org/۱۰.۳۳۹۰/ijms۲۲۱۲۶۵۵۲ ۱۵.Spencer P , Ye Q , Song L , Parthasarathy R , Boone K , Misra A , et al. Threats to adhesive/dentin interfacial integrity and next generation bio‐enabled multifunctional adhesives. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. ۲۰۱۹ Nov , ۱۰۷(۸):۲۶۷۳-۸۳.. ۱۶.Hardan L , Lukomska-Szymanska M , Zarow M , Cuevas-Suárez CE , Bourgi R , Jakubowicz N , Sokolowski K , et al. One-Year Clinical Aging of Low Stress Bulk-Fill Flowable Composite in Class II Restorations: A Case Report and Literature Review. Coatings. ۲۰۲۱ Apr ۲۵ , ۱۱(۵):۵۰۴.doi.org/۱۰.۳۳۹۰/coatings۱۱۰۵۰۵۰۴. ۱۷.Hardan L , Bourgi R , Cuevas-Suárez CE , Zarow M , Kharouf N , Mancino D , et al. The bond strength and antibacterial activity of the universal dentin bonding system: A systematic review and meta-analysis. Microorganisms. ۲۰۲۱ Jun ۶ , ۹(۶):۱۲۳۰.doi.org/۱۰.۳۳۹۰/microorganisms۹۰۶۱۲۳۰. ۱۸.Bourgi R , Daood U , Bijle MN , Fawzy A , Ghaleb M , Hardan L. Reinforced universal adhesive by ribose crosslinker: A novel strategy in adhesive dentistry. Polymers. ۲۰۲۱ Feb ۲۶ , ۱۳(۵):۷۰۴.doi.org/۱۰.۳۳۹۰/polym۱۳۰۵۰۷۰۴ ۱۹.Xie SX , Boone K , VanOosten SK , Yuca E , Song L , et al. Peptide mediated antimicrobial dental adhesive system. Applied Sciences. ۲۰۱۹ Feb ۸ , ۹(۳):۵۵۷. doi.org /۱۰.۳۳۹۰/app۹۰۳۰۵۵۷. ۲۰.Su M , Yao S , Gu L , Huang Z , Mai S. Antibacterial effect and bond strength of a modified dental adhesive containing the peptide nisin. Peptides. ۲۰۱۸ Jan ۱ , ۹۹:۱۸۹-۹۴.doi.org/۱۰.۱۰۱۶/j.peptides.۲۰۱۷.۱۰.۰۰۳. ۲۱.Zhao M , Qu Y , Liu J , Mai S , Gu L. A universal adhesive incorporating antimicrobial peptide nisin: Effects on Streptococcus mutans and saliva-derived multispecies biofilms. Odontology. ۲۰۲۰ Jul , ۱۰۸:۳۷۶-۸۵.doi.org/۱۰.۱۰۰۷/s۱۰۲۶۶-۰۱۹-۰۰۴۷۸-۸. ۲۲.Wieman TJ , Smiell JM , Su Y. Efficacy and safely of a topical gel formulation of recombinant human platelet-derived growth factor-BB (becaplermin) in patients with chronic neuropathic diabetic ulcers: a phase III randomized placebo-controlled double-blind study. Diabetes care. ۱۹۹۸ May ۱ , ۲۱(۵):۸۲۲-۷.doi.org/۱۰.۲۳۳۷/diacare.۲۱.۵.۸۲۲. ۲۳.Engström U , Engström A , Ernlund A , Westermark B , Heldin CH. Identification of a peptide antagonist for platelet-derived growth factor. Journal of Biological Chemistry. ۱۹۹۲ Aug ۱۵ , ۲۶۷(۲۳):۱۶۵۸۱-۷. doi.org/۱۰.۱۰۱۶/S۰۰۲۱-۹۲۵۸(۱۸)۴۲۰۴۲-X. ۲۴.Lin X , Takahashi K , Liu Y , Derrien A , Zamora PO. A synthetic , bioactive PDGF mimetic with binding to both α-PDGF and β-PDGF receptors. Growth Factors. ۲۰۰۷ Jan ۱ , ۲۵(۲):۸۷-۹۳.doi.org/۱۰.۱۰۸۰/۰۸۹۷۷۱۹۰۷۰۱۵۵۳۴۴۹. ۲۵.Deptuła M , Karpowicz P , Wardowska A , Sass P , Sosnowski P , Mieczkowska A , et al. Development of a peptide derived from platelet-derived growth factor (PDGF-BB) into a potential drug candidate for the treatment of wounds. Advances in Wound Care. ۲۰۲۰ Dec ۱ , ۹(۱۲):۶۵۷-۷۵.doi.org/۱۰.۱۰۸۹/wound.۲۰۱۹.۱۰۵۱. ۲۶.Zhang P , Zhang G , Wang W. Ultrasonic treatment of biological sludge: floc disintegration , cell lysis and inactivation. Bioresource technology. ۲۰۰۷ Jan ۱ , ۹۸(۱):۲۰۷-۱۰.doi.org/۱۰.۱۰۱۶/j.biortech.۲۰۰۵.۱۲.۰۰۲. ۲۷.Doonan S. Chromatography on hydroxyapatite. Protein purification protocols. ۲۰۰۴:۱۹۱-۴.doi.org/۱۰.۱۳۸۵/۱-۵۹۲۵۹-۶۵۵-X:۱۹۱. ۲۸.Haan C , Behrmann I. A cost effective non-commercial ECL-solution for Western blot detections yielding strong signals and low background. Journal of immunological methods. ۲۰۰۷ Jan ۱۰ , ۳۱۸(۱-۲):۱۱-۹. doi.org/۱۰.۱۰۱۶/j.jim.۲۰۰۶.۰۷.۰۲۷. ۲۹.Implants for Surgery: In Vitro Evaluation for Apatite-forming Ability of Implant Materials: ISO Copyright Office.۲۰۱۲.International Organization for S. ۳۰.Hwang YE , Im S , Cho JH , Lee W , Cho BK , Sung BH , et al. Semi-biosynthetic production of surface-binding adhesive antimicrobial peptides using intein-mediated protein ligation. International Journal of Molecular Sciences. ۲۰۲۲ Dec ۲ , ۲۳(۲۳):۱۵۲۰۲.doi.org/۱۰.۳۳۹۰/ijms۲۳۲۳۱۵۲۰۲. ۳۱.Bahri M , Hasannia S , Dabirmanesh B , Zadeh HH. Purification of Recombinant Fusion Peptide Containing Hydroxyapatite Affinity Tag Using Ceramic Chromatography Column. Modares Journal of Biotechnology. ۲۰۱۹ Dec ۱۰ , ۱۰(۴):۶۵۵-۶۴. ۳۲.Werner S , Grose R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiological reviews. ۲۰۰۳ Jul , ۸۳(۳):۸۳۵-۷۰.doi.org/۱۰.۱۱۵۲/physrev.۲۰۰۳.۸۳.۳.۸۳۵. ۳۳.Park JW , Hwang SR , Yoon IS. Advanced growth factor delivery systems in wound management and skin regeneration. Molecules. ۲۰۱۷ Jul ۲۷ , ۲۲(۸):۱۲۵۹.doi.org/۱۰.۳۳۹۰/molecules۲۲۰۸۱۲۵۹. ۳۴.Guo SA , DiPietro LA. Factors affecting wound healing. Journal of dental research. ۲۰۱۰ Mar , ۸۹(۳):۲۱۹-۲۹.doi/abs/۱۰.۱۱۷۷/۰۰۲۲۰۳۴۵۰۹۳۵۹۱۲۵. ۳۵.Ghasemi Y , Ghoshoon MB , Taheri M , Negahdaripour M , Nouri F. Cloning , expression and purification of human PDGF-BB gene in Escherichia coli: New approach in PDGF-BB protein production. Gene Reports. ۲۰۲۰ Jun ۱ , ۱۹:۱۰۰۶۵۳.. doi.org/۱۰.۱۰۱۶/j.genrep.۲۰۲۰.۱۰۰۶۵۳. ۳۶.Dyson MR , Shadbolt SP , Vincent KJ , Perera RL , McCafferty J. Production of soluble mammalian proteins in Escherichia coli: identification of protein features that correlate with successful expression. BMC biotechnology. ۲۰۰۴ Dec , ۴:۱-۸.doi.org/۱۰.۱۱۸۶/۱۴۷۲-۶۷۵۰-۴-۳۲. ۳۷.Fateme R , Fatemeh G , Sima S , Moshaverinia A , Hasannia S. New engineered fusion peptide with dual functionality: antibacterial and strong binding to hydroxyapatite. International Journal of Peptide Research and Therapeutics. ۲۰۲۰ Sep , ۲۶:۱۶۲۹-۳۹.doi.org/۱۰.۱۰۰۷/s۱۰۹۸۹-۰۱۹-۰۹۹۶۳-۸. ۳۸.Vij N , Sharma A , Thakkar M , Sinha S , Mohan RR. PDGF-driven proliferation , migration , and IL۸ chemokine secretion in human corneal fibroblasts involve JAK۲-STAT۳ signaling pathway. Molecular vision. ۲۰۰۸ , ۱۴:۱۰۲۰. ۳۹.Izumi K , Zheng Y , Li Y , Zaengle J , Miyamoto H. Epidermal growth factor induces bladder cancer cell proliferation through activation of the androgen receptor. International journal of oncology. ۲۰۱۲ Nov ۱ , ۴۱(۵):۱۵۸۷-۹۲.doi.org/۱۰.۳۸۹۲/ijo.۲۰۱۲.۱۵۹۳. ۴۰. Xiao L , Du Y , Shen Y , He Y , Zhao H , Li Z. TGF-beta ۱ induced fibroblast proliferation is mediated by the FGF-۲/ERK pathway. Front Biosci (Landmark Ed). ۲۰۱۲ Jun ۱ , ۱۷(۷):۲۶۶۷-۷۴.doi:۱۰.۲۷۴۱/۴۰۷۷.