مریم پی پل زاده - دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی دانشگاه دمشق
سلام لاوند - دانشیار دانشگاه دمش
حمید رجبی معماری - استادیار دانشگاه شهید چمران اهواز
محمد رعایایی اردکانی - دانشیار دانشگاه شهید چمران اهواز

پروتئین t-PA(Tissue- type Plasminogen activatior) از مهمترین فعال کننده های پلاسمینوژن در جریان خون است که در درمان آنفارکتوس قلبی و سایر مشکلات ترومبوزی مورد استفاده قرار می گیرد. فاکتور نوترکیب( K25(Reteplase، یک فرم موتانت حذفی از مولکول t-PA انسانی است که به فرم غیر گلیکوزیله و inclusion body با تکنیک مهندسی ژنتیک در E.coli بیان می گردد، به طوریکه جهت استفاده از این پروتئین به صورت فاکتور فعال، به فرایندهای استخراج، خالص سازی، refolding و گلیگوزیلاسیون در شرایط in vitro نیاز است. از آنجا که گلیکوزیلاسیون و فولدینگ صحیح این پروتئین در عملکرد آن بسیار مهم است، تولید نوترکیب آن در سیستم های یوکاریوتی از جمله مخمر گزینه مناسب تری محسب می گردد. مخمر P.Pastoris یکی از میزبان های یوکاریوتی مناسب جهت تولید پروتئین های نوترکیب است که به علت دارا بودن پروموترهای قوی قابل القا نظیر الکل اکسیداز 1(AOX1)، قابلیت بیان بالا و سریعی از ژن های نوترکیب را دارد. در بررسی حاضر، توالی ژنی K2S، با استفاده از آغازگرهای اختصاصی رفت و برگشتی تکثیر شد. پس از هضم ناقل بیانی اختصاصی pPIC3.5k و محصول PCR توالی K2S با استفاده از آنزیمهای برشی مناسب، هر دو محصول برش خورده در واکنش اتصال شرکت داده شدند و در مرحله بعد، محصول اتصال طی فرایند ترانسفورماسیون به روش شوک حرارتی به سلول های مستعد E.coli انتقال داده شد. در نهایت صحت محصول همسانه سازی شده طی فرایندهای PCR, Colony PCR و هضم آنزیمی تأئید و جهت آنالیز دقیق تر تعیین توالی گردید.

؛Pichia pastori,pPIC3.5k, K25, t-PA، همسانه سازی