کلونینگ، بیان ژن وتخلیص آنزیم CEL I اندونوکلئاز از گیاه کرفس

آنزیم ICEL کی مانوزیل گلیکوپروتئین مخصوص گیاهی است که از دسته کرفس استخراج می شود و از جمله اولین آنزیم یوکاریوتی است که پیوند ناجور را با کی اختصاص ییت بالا در یکی از دو رشته DNA برش می دهد. هدف از این پژوهش کلون کردن ژن CEL I در محیط آزمایشگاهی است. در این تحقیق از گیاه کرفس، RNA استخراج شد، و cDNA ساخته شد. ژن CEL I اندونوکلئاز با پرایمرهای اختصاصی از طریق ( PCR ) تکثیر شد و سپس ژن تکثیر شده در Tوکتور کلون گردید. پلاسمید نوترکیب به سلول پذیرای سویه TOP10 باکتری اشرشیاکلی انتقال یافت. پلاسمید نوترکیب استخراج و توسط آنزیم های محدود کننده BamHI, SacI هضم گردید. محصول PCR خالص شده، در وکتور بیانی pET32a ساب کلون شد. این وکتورنوترکیب به سلول پذیرای سویه BL21 باکتری اشرشیاکلی انتقال یافت و با تکن کی های کلونی PCR وهضم آنزیمی تا یید گردید. کلونی حاوی وکتور بیانی نوترکیب کشت شبانه داده شد با استفاده از IPTG ،پروموتور ژن القا شدودر ساعت های متفاوت نمونه گیری انجام گرفت و روی ژل10% SDS-PAGE الکتروفورز شد. باندهای پروتئینی ژل بر روی کاغذ نیتروسلولز انتقال داده شد وسترن بلاتینگ انجام گرفت. با لیز رسوب های باکتری، نمونه ها از روی ستون کروماتوگرافی تمایلی ( S.Tag/His.Tag ) عبور داده شد و سپس کروماتوگرام رسم شد در ادامه روی ژل 10% SDS-PAGE الکتروفورز شد. باندهای پروتئینی ژل بر روی کاغذ نیتروسلولز انتقال داده شد وسترن بلاتینگ انجام گرفت .در نهایت آنزیم CEL I در شرایط آزمایشگاهی با موفقیت تولید شد.

Keywords:

آنزیم CELI اندونوکلئاز , , وسترن بلاتینگ , پلاسمید pET32a , پروتئین نوترکیب , کروماتوگرافی تمایلی