بررسی اثر پری-پروی پروترومبین خوکی بر بیان فاکتور 9 انسانی در رده سلولی پستانداران

فاکتور 9 یکی از سرین پروتئازهای مسیر انعقادی با تعداد زیادی تغییرات پس از ترجمه است. مشابه با سایر پروتئین های وابسته به ویتامینKپروپپتید بعد از پپتید نشانه قرار دارد که نقش مهمی در گاما کربوکسیلاسیون ایفا میکند. پروترومبین یک پروتئین وابسته بهویتامینK است که در هموستازی نقش دارد، و به دلیل تمایل کم پروپپتید پروترومبین به آنزیم گاما کربوکسیلاز، به طور موثر گاماکربوکسیله میشود. به منظور بررسی تاثیر جایگزینی توالی پری-پرو پپتید در کارایی بیان فاکتور 9 انسانی، از توالی پری-پروی پروترومبین خوکی استفاده شد که 83 درصد تشابه در توالی اسیدهای آمینه با همتای انسانی خود دارد. کارایی پپتید نشانه پروترومبین خوکی و ساختار ثانویهmRNAبا برنامه های آنلاینmfold و signalP, prediSi, Toppredپیش بینی شد. با استفاده از تکنیکهای مولکولی، توالی کد کننده پری-پروی پروترومبین خوکی بهcDNAبالغ فاکتور 9 انسانی متصل شد و قطعات کایمریک ایجاد شده به موازات توالی بومی فاکتور 9 انسانی در رده سلولی پستانداران هدف آنالیزهای بیانی قرار گرفتند. تاًیید ترانسفکشن و ارزیابی بیان فاکتور 9 انسانی با روشهای الایزا، تست انعقادی، رسوبدهی باریوم سیترات RT- qPCR و RT-PCRانجام شد. براساس آنالیزهای بیوانفورماتیکی، زمانی که از توالی پری-پروی پروترومبین خوکی استفاده میشود، بیشترین کارایی ترشح فاکتور 9 انسانی مورد انتظار است. نتایج ما نشان داد که میزان ترشح و فعالیت انعقادی فاکتور 9 نوترکیب انسانی در سلولهایHEK293Tبرای کلونpProt::FIXدر مقایسه با کلون بومی فاکتور 9 بیشتر بود که بترتیب به دلیل تمایل بیشتر پپتید نشانه بهSRPو تمایل کمتر پروپپتیدپروترومبین به آنزیم گاما کربوکسیلاز است. میزان بیان ترانسژنهای فاکتور 9 در سطح رونویسی با روشqRT-PCR16 برابر افزایش بیان برای کلون pProt::FIXدر مقایسه با کلون بومی فاکتور 9 نشان از تاثیر چشمگیرتغییر توالی های نشانه پری-پرو بر روی نسخه برداری ژن مربوطه دا رد.

Keywords:

فاکتور 9 انسانی , Signal P , PrediSi , پروترومبین خوکی , پروپپتید