رضا پیله چیان لنگرودی - بخش تحقیق و تولید واکسن های بی هوازی، موسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی

باکتریClostridium perfringensیک باسیل گرم مثبت، بی هوازی، اسپورزا است. کلستریدیوم پرفرینجنز باکتری بیماریزای مهمی است که انسات و دام را مبتلا کرده و باعث ایجاد محدوده وسیعی از بیماری ها شامل اسهال، بیماری های نکروز دهنده بافتی و گازگانگرن در انسان و انتروتوکسمی کشنده در دام می گردد. این باکتری حداقل 15 نوع توکسین مختلف تولید می کند که در بیماریزائی آن نقش دارند. بر اساس تولید چهار توکسین مهم و اصلی آلفا، بتا، اپسیلون و یوتا در پنج گروهA ,B ,C ,D, Eقرارداده شده است. هدف: تولید توکسین اپسیلون کلستریدیوم پرفرینجنز تیپ Dبه روش نوترکیب. روش تحقیق: ژنوم باکتری کلستریدیوم پرفرینجنز تیپD تخلیص شده وژن کد کننده توکسین اپسیلون etx به وسیله آنزیم pfuتکثیر و در پلاسمید pJET1.2bluntلایگیت شد E.coli/TOP10با استفاده ازpJETεترانسفورم شد و غربالگری آن به روش مقاومت آنتی بیوتیکی وcolony PCRانجام شد. پلاسمید های نوترکیبpET22b(+) و pJETε با استفاده ازXhoI و NdeIبرش خورده و ژنetxو پلاسمید خطی شدهpET22b(+)تخلیص و به وسیله الکتروفورز ژل آگاروز ارزیابی شدند. ژنetxدرpET22b(+)لایگیت و بهE. coli/rosettaمنتقل شد. سلول های نوترکیب به روش مقاومت آنتی بیوتیکی وcolony PCRهویت یابی شدند. کلون های نوترکیب در محیط کشت حاوی آمپی سیلین در 37 درجه سانتیگراد تاOD600=0.6 کشت داده شدند. بیان توکسین اپسیلون با افزودنIPTG 0/5 mMالقاء گردید، برای تایید بیانSDS-PAGEوسترن بلاتینگ و تخلیص پروتئین با رزینNi-NTAانجام شد. نتیجه: با بررسی های بیان مشاهده گردید که بیان توکسین اپسیلون در کلون نوترکیبE. coli/rosetta/pETεبه خوبی صورت گرفته است. این تحقیق که برای اولین بار در ایران صورت پذیرفته است از نظر تهیه واکسن نوترکیب کاملا ضروری و با اهمیت است

کلستریدیوم پرفرینجنز، توکسین اپسیلون، ژنetx ، کلونینگ، بیان، واکسن نوترکیب