کلونینگ و بررسی بیان ژن کد کننده BMP-2 انسانی در باکتری E.coli به منظور تولید یک داروی نوترکیب

مقدمه و هدف: پروتئین های مورفوژنتیک استخوانی، گروهی از سایتوکاین های متعلق به ابرخانواده TGFβ می باشند. اینپروتئین ها در تکامل بسیاری از ارگان ها و بافت ها، طی دوران جنینی و پس از آن در ترمیم و بازسازی بافت های استخوان و غضروف، نقش دارند. هدف از این مطالعه، کلونینگ و بررسی بیان این پروتئین در باکتری E.Coli می باشد. روش کار: در این مطالعه تجربی توالی cDNA مربوط به پپتید بالغ پروتئین مورفوژنتیک انسانی 2 (BMP-2) در باکتری E.Coli کلون شد. پلاسمید نوترکیب ET28a/BMP-2 پس از توالی یابی به باکتری بیانی (E.coli BL21(DE3 ترانسفرم گردید. باکتری نوترکیب در محیط LB مایع حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین در دمای 37˚C کشت داده شد. القا با IPTG صورت گرفت. بررسی بیان به کمک RT-PCR و SDS-PAGE و تأیید بیان با وسترنبلاتینگ انجام شد. نتایج: توالی ژنی به کمک PCR تک ثیر یافت . بعد از آماده سازی ژن و پلاسمید، واکنش اتصال صورت گرفت . توالی یابی، صحت کلونینگ را نشان داد. بررسی بیان با RT-PCR و SDS-PAGE نشاندهنده بیان پروتئین بود. وسترن بلاتینگ نتایج را تأیید کرد. نتیجه نهایی: بیان بالای پروتئین نوترکیب در سیستم پروکاریوتی حاصل شد. استفاده از غلظتهای متفاوت القا کننده در ساعت های مختلف نشان داد که 4 ساعت بعد از القا با غلظت 1mM از IPTG بیشترین بیان را داریم.

Keywords:

اشریشیاکلی , پروتئین های مورفوژنتیک استخوانی , پروتئین های نوترکیب