کلونینگ آنزیم فسفولیپاز باکتریایی ناتریالبا آسیاتیکا در وکتور pET-28a

فسفولیپاز (کربوکسیل استراز EC 3.1.1 ) آنزیمی است که پیوندهای استری آبگریز تری گلیسرول و فسفولیپیدها را، هیدرولیز می کنند . این آنزیم همچنین مجموعه ای از واکنش های دیگر را کاتالیز می کنند . بعنوان مثال : آسیل ترانسفراز، ترانس آسیلاز و فعالیت های ترانس فسفوتیداسیون . آنزیم فسفولیپاز جز کاتالیزورهای حیاتی چند منظوره است که به طور گسترده ای در برنامه های مختلف صنعتی استفاده می شود، از جمله برای بیودیزل، مواد غذایی، مواد افزودنی بیولوژیکی فعال، صمغ ، نفت و مواد شوینده . و همچنین در صنعت تولید لوازم اصلاح زیستی، کشاورزی، لوازم آرایشی، چرم و کاغذ کاربردی جزیی نیز دارند. این آنزیم در بیشتر موجودات زنده در سراسر حیوانات، گیاهان، مخمرها، قارچ ها و باکتری وجود دارند. همچنین به نظر می رسد فسفولیپازهای ترشحی ، عامل کلیدی حدت اثرات پاتوفیزیولوژیک هستند، که در باکتری موجب کمک به بقا یا توزیع باکتریایی بدون ایجاد تخریب بافتی می گردند . توسعه روش های مولکولی برای تولید پروتیین های نوترکیب در سیستم های میزبان ناهمگون، بر محدودیت های تکثیر غلبه کرده است. چرا که اجازه می دهد تا پروتیین در سطح بالا بیان شود و آنزیم های جدید با خواص کاتالیزوری بهبود یافته ، طراحی و تولید شوند. در پژوهش حاضر، ژن فسفولیپاز از آرکی نمک دوست ناتریالبا آسیاتیکا با روش PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی (شامل سایت های برش EcoRI و HindIII) تکثیر گردید. پلاسمید pET-28a بعنوان وکتور کلونینگ ، از باکتری E.coli سویه DH5α استخراج گردید . سپس پلاسمید و ژن فسفولیپاز توسط آنزیم های محدودالاثر ذکر شده ، هضم و الحاق شدند. PET-28a حاوی ژن فسفولیپاز به سلول E.coli DH5a منتقل گردید . غربالگری با استفاده از محیط کشت جامد LB-آگار حاوی کانامایسین انجام شد . ژن فسفولیپاز نوترکیب با استفاده از هضم دوگانه مورد آزمایش قرار گرفت. در نهایت تعیین توالی نوکلیوتیدی با استفاده از پروموتر T7 شرکت ماکروژن کره تایید گردید

Keywords:

آنزیم فسفولیپاز , کلونینگ , ناتریالبا آسیاتیکا , pET-28a