کلون ژن، بیان و تخلیص آنزیم کربوکسی پپتیداز G2 به واسطه اینتیین

متوتروکسات یکی از داروهای پر مصرف در شیمی درمانی است که نارسایی کلیوی یکی از عوارض جانبی آن است. آنزیم کربوکسی پپتیداز (گلوکارپیداز) آنزیمی باکتریایی است که می تواند متوترکسات را به متابولیت های غیر فعال خود تبدیل کند و پس از درمان با دوز بالای متوترکسات منجر به حذف متوتروکسات از مسیر غیر کلیوی را فراهم می کند. گلوکارپیداز تحت نام تجاری وراکساز به بازار عرضه می شود 26.775 دلار به ازاء هر ویال 1000 یونیتی آنزیم). هدف این پروژه ارایه روشی نوین در خالص سازی این آنزیم با ارزش است که به واسطه اینتیین ودنباله تمایلی کیتین به انجام می رسد. ابتدا وکتور واسطه اینتیین ودنباله تمایلی کیتین به انجام می رسد. ابتدا وکتور که حاوی ژن کربوکسی پپتیداز G2 است تهیه شد و به عنوان الگو در واکنش PCR به همراه پرایمر دارای سایت برش Nde1 و SapI قرار گرفت این وکتور بیانی قرار گرفت این وکتور بیانی1 دارای یک قطعه اینتیینی و دنباله تمایلی کیتین جداشونده با تیولدر ناحیه C ترمینال می باشد. پلاسمید نوترکیب ساخته شده درون باکتری E.coli سویه بیانی BL21 ترنسفورم شد و تحت شرایط بیانی مختلف بیان قرارگرفت. بیشترین سطح بیان درغلظت 0/1 میلی مولار IPTG، دمای 18 درجه سانتی گراد و مدت زمان انکوباسیون 6 ساعت تعیین شد. در انتها پروتیین مورد نظر از طریق کروماتوگرافی تمایلی توسط ستون کیتین تخلیص و فعالیت آن بررسی شد

Keywords:

متوتروکسات , کربوکسی پپتیداز G2 , اینتیین , تخلیص