طراحی سیستم الایزا رقابتی بر مبنای پروتیین نوترکیب HA ویروس آنفلوانزا H9N2 برای تشخیص تفکیک همزمان آن از سایر تحت تیپ های ویروس

در بهینه سازی شرایط کنترل بیماری آنفلوانزا پایش مستمر مزارع پرورشی طیور، به آزمایشی حساس اختصاصی نیاز است به گونه ای که تعداد زیاد نمونه با هزینه کم در اوایل بیماری تشخیص داده شوند. با استفاده از کیتهای تجاری الایزا فقط آنتیبادی اختصاصی علیه پروتیینهای داخلی که در ویروسهای فوق حاد تحت حاد آنفلوانزای پرندگان مشابهند، بدون تعیین تحت تیپ قابل تشخیص است. برای شناسایی آنتیبادی تولید شده علیه سویه معین باید از گلیکوپروتیین سطحی HA که القا کننده اصلی آنتیبادیهای خنثی کننده است استفاده کرد. در این پژوهش برای دست یابی به روش هم زمان تشخیص تفکیک تحت تیپ H9N2 از سایر تحت تیپهای ویروس آنفلوانزا همراه با ارزیابی سطح آنتیبادی در شرایط فیلد، سیستم الایزای رقابتی بر مبنای پروتیین نوترکیب HAویروس آنفلوانزا H9N2 بیان شده در سیستم باکولوویروس طراحی شد. ابتدا ژن کامل HA زیر واحد HA1 ویروس H9N2 از نمونه های بافتی پرندگان جدا شده احتمال بروز تغییرات در توالی های نوکلیوتیدی این ژن در جدایه اخیر با جدایههای قبلی ارزیابی شد. پردازش نتایج بیانگر این بود که ژن HA در جدایه اخیر دستخوش تغییراتی شده است بنابراین ادامه مطالعه برمبنای ویروس A/chicken Iran/SS2/2008 انجام شد. قطعات ژنی HAF HA1 در پلاسمید دهنده pFastBac HTB کلون شده بکمیدهای نوترکیب بدست آمد. رده سلولی Sf9 با بکمیدهای نوترکیب آلوده شده باکولوویروسهای نوترکیب تولید شدند.پروتیینهای نوترکیب HAF HA1 با روشهای SDS-PAGE، وسترن بلاتینگ استفاده از آنتیبادی تک دودمانی اختصاصی تایید شدند. میکروپلیتهای الایزا با مقادیر مناسب پروتیین های نوترکیب حاصل پوشانده شده پس از طی مراحل آماده سازی، با آنتیسرمهای استاندارد مشکوک تحت تیپ H9N2، آنتی سرم استاندارد تحت تیپ H5N1 آنتیسرم استاندارد ویروس بیماری نیوکاسل مجاور شدند. نتایج حاصل از ارزیابی عیار آنتی بادی، ویژگی حساسیت آزمایش الایزا بر مبنای پروتیین های نوترکیب HA HA1 باهم، با نتایج حاصل از کیت تجاری الایزا آزمایش HI مقایسه پردازش شدند. نتایج نشان داد که در مقایسه با سایر روشهای سرولوژی مولکولی، الایزای رقابتی طراحی شده بر مبنای پروتیین نوترکیب HA1 آزمایشکارآمدی برای استفاده در موارد تشخیصی غربالگری ویروس آنفلوانزا تحت تیپ H9N2 است.

Keywords:

ویروس آنفلوانزای پرندگان , پروتیین نوترکیب , هماگلوتینین , الایزا رقابتی