تولید آنتی بادی پلی کلنال علیه ویروس لکه حلقوی نکروتیک هسته دارها (PNRSV) با استفاده از پروتیین پوششی نوترکیب

در روند تولید نهال سالم و نیز مطالعات تعیین پراکنش و مدیریت بیماری های ویروسی درختان میوه هسته دار، نیاز به بررسی تعداد زیادی نمونه می باشد. روش سرولوژیکی الایزا هنوز هم یکی از بهترین انتخاب ها برای انجام بررسی آلودگی درختان و نیز صدور گواهی سلامت می باشد. ویروس لکه حلقوی بافت مرده هسته دارها (Prunus necrotic ringspot virus-PNRSV) یکی ازمهم ترین ویروس های آلوده کننده درختان هسته دار می باشد که به جنس Ilarvirus تعلق دارد. فن آوری دی.ان.ای نوترکیب، برای تولید پروتیین پوششی همسانه سازی شده در باکتری، موجب صرفه جویی در هزینه و وقت برای خالص-سازی پیکره ویروس و رفع مشکلات مرتبط با حفظ و نگه داری جدایه های ویروس در گلخانه و آزمایشگاه می باشد. در این تحقیق ضمن مطالعه و جمع آوری نمونه های مشکوک علایم دار از درختان میوه هسته دار از پنج استان، جدایه های PNRSV با استفاده از آزمون الایزا در آن ها ردیابی شده و ژن پروتیین پوششی (CP) آنها همسانه سازی و تعیین توالی گردید. یکی از جدایه های شایع ویروس، انتخاب شده (جدایه PNRSV-PK5) وبا طراحی آغازگرهای اختصاصی ژن CP این ویروس، تکثیر و در ناقل بیانی pET28a(+) همسانه سازی گردید. پس از تراریخت نمودن سلول های سوش BL21 باکتری E. coli، بیان ژن CP در این سلول ها با استفاده از SDS-PAGE و وسترن بلات مورد آزمون قرار گرفته و تولید پرتیینی بوزن مورد انتظار حدود 27 کیلودالتون که با آنتی بادی مرجع PNRSV در آزمون وسترن بلات واکنش مثبت داشت، مورد تایید قرار گرفت. پروتیین پوششی نوترکیب (rCP) خالص سازی شده و با تزریق این پروتیین در خرگوش سفید نیوزیلندی، آنتی سرم علیه آن تهیه شد. نتایج آزمون الایزا با استفاده از آنتی بادی اختصاصی علیه جدایه ایرانی PNRSV-PK5، نشان داد که این آنتی بادی دارای تیتری معادل 1:1000 بود. غلظت بهینه IgG و IgG-Conj تهیه شده در این تحقیق، بترتیب 2 میلی گرم در میلی لیتر و 400 نانوگرم در میلی لیتر تعیین گردید و این سیستم تشخیصی قادر به ردیابی آلودگی ویروسی PNRSV در بافت گیاهی بود. لغات کلیدی: بیماری های ویروسی، تشخیص، ردیابی، Prunus necrotic ringspot virus