بهینه سازی کدون و همسانه سازی ژن پروکیموزین گاوی برای بیان مناسب در گیاه توتون

آنزیم کیموزین گاوی یکی از آنزیم­های رایج مورد استفاده در صنعت لبنیات می ­باشد. تهیه­ این آنزیم از منبع طبیعی آن جوابگوی نیاز این صنعت عظیم نمی­ باشد. تولید کیموزین گاوی نوترکیب در گیاهان می­تواند یک جایگزین مناسب برای تهیه­ این آنزیم باشد. درج و بیان ژن­های خارجی در گیاهان می­تواند در اندامک هسته و کلروپلاست انجام گیرد. میزان بیان ژن خارجی در میزبان­های هترولوگ یوکاریوت را می­توان با بهینه ­سازی کدون­های آن و همچنین سوق دادن پروتئین هترولوگ بعد از بیان به اندامک­های محصور شده از قبیل کلروپلاست افزایش داد. در این تحقیق، بهینه­ سازی کدون­ها­ی ژن پروکیموزین گاوی طوری انجام گرفت که هم زمان برای بیان در هسته و کلروپلاست گیاه توتون مناسب باشد. پس از بهینه ­سازی، شاخص CAI این ژن برای اندامک هسته و کلروپلاست به ترتیب ۰.۹۲۹ و ۰.۹۴۷ بدست آمد. توالی بهینه شده این ژن پس از سنتز مصنوعی روی ناقل پایه pUC۵۷ سوار شده، و از طریق توالی­ یابی تایید شد. عملکرد ژن سنتز شده از طریق بیان در باکتری E. coli و آزمایش لخته شدن شیر تایید گردید. برای تهیه ناقل بیانی مناسب برای انتقال ژن به ژنوم هسته گیاهان، ژن پروکیموزین در ناقل بیانی p۳۵S-TP-GFP  جایگزین ژن GFP گردید. این ناقل برای انتقال ژن به روش تفنگ ژنی مناسب بوده و با دارا بودن پپتید نشانه کلروپلاستی، باعث تجمع پروتئین در کلروپلاست می­شود. همچنین، این ژن در ناقل pBI۱۲۱، که برای انتقال ژن به روش آگروباکتریوم مناسب است، جایگزین ژن GUS شد. ناقل­های نوترکیب ساخته شده در این تحقیق می­توانند برای انتقال و بیان موثر این آنزیم صنعتی در گیاهان بکار گرفته شود.

Keywords:

Milk coagulation enzyme , Codon preference , Recombinant chymosin , Expression vector , آنزیم لخته کننده شیر , ترجیح کدونی , کیموزین نوترکیب , ناقل بیانی