کاربرد تکنیک RFLP-PCR جهت تمایز بین ارقام نخود حساس و مقاوم به بیماری برق زدگی

بیماری برق زدگی یکی از مخرب ترین بیماری های رایج کشت نخود در سراسر دنیا به شمار میرود این بیماری توسط قارچ بیماری زای Ascochyta rabiei ایجاد می گردد. یکی از موثرترین راه های مقابله با این بیماری استفاده از ارقام مقاوم است. اخیرا تعدادی از محققان چند شکلی های تک نوکلئوتیدی (SNPs) را در نواحی از ژنوم به طول تقریبی ۱۰۰Kbبر روی کروموزوم شماره ۴ نخود را شناسایی کرده اند که که در ایجاد مقاومت به بیماری برق زدگی نقش بسزایی دارد. در این پژوهش با استفاده از روش های مولکولی و به کمک نرم افزارهای بیوانفورماتیکی شناسایی و تفکیک ارقام حساس از مقاوم نخود انجام شده است. برای یکی از نواحی معرفی شده یک جفت آغازگر طراحی گردید. انجام PCR با آغازگرهای طراحی شده از ناحیه SNP نشان داد قطعه مورد نظر در ارقام حساس و مقاوم به شکل یکسانی تکثیر شده اند. نتایج توالی یابی محصول PCR رقم مقاوم MCC۱۳۳ و حساس ILC۲۶۳ نشان داد که این ارقام درجایگاه ۲۷۵۷ژن LOC۱۰۱۴۹۱۶۶۷ در یک نوکلئوتید از قطعه خوانش شده با یکدیگر تفاوت دارند. بررسی های تکمیلی با استفاده از نرم افزار Snap Gene نشان داد که آنزیم برشی MnlI در موقعیت SNP یافت شده جایگاه تشخیص برش دارد. به این معنی که در صورت عدم وجود SNP هضم آنزیمی انجام میشود و در صورت وجود SNP هضم آنزیمی انجام نخواهد شد. وب سایت آنلاین Restriction Analyzer نشان داد در اثر هضم آنزیمی محصول PCR رقم ILC۲۶۳ هیچ برشی در طول قطعه حاصل نشد که نتیجه عدم حضور SNP در جایگاه مورد نظر و در نتیجه عدم برش است. اما در اثر هضم آنزیمی محصول PCR رقم MCC۱۳۳ دوباند به طول های ۴۶۵bp و ۱۷۲bp حاصل شد که نتیجه برش توسط آنزیم MnlI در جایگاه SNP ذکر شده است. از این رو آنزیم برشی MnlI قابلیت تفکیک و تمایز رقم حساس ILC۲۶۳ از رقم مقاوم MCC۱۳۳ با نمایش الگوی باندی متفاوت را دارد.

Keywords:

آنزیم برشی , Ascochtya rabiei , مارکرمولکولی , ژن مقاومت