استخراج آنزیم کراتینیناز و بررسی اثر غلظت های مختلف نانوذرات طلا بر فعالیت آنزیم

سابقه و هدف: استفاده از آنزیم کراتینیناز یک روش آنزیمی جهت سنجش میزان کراتین و کراتینین در مایعات بدن با هدف بررسی سلامت کلیه ها است. هدف از این تحقیق، بررسی اثر نانوذرات طلا بر فعالیت و پایداری آنزیم کراتینیناز به جهت استفاده در کیت های سنجش کراتین و کراتینین است. مواد و روش ها: در این مطالعه ابتدا باکتری E.Coli BL۲۱  حاوی وکتور تکثیری pET۲۸a حاوی ژن آنزیم کراتینیناز در محیط LB مایع کشت و سپس در دمای ۲۸ درجه القا بیان گردید. در ادامه پس از سونیکاسیون، تخلیص آنزیم  با کمک کروماتوگرافی تمایلی انجام شد. پس از تایید بیان با SDS-PAGE ، غلظت آنزیم بیان شده با روش برادفورد سنجش شد. در ادامه فعالیت آنزیم با روش رنگ سنجی در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا بررسی و مقایسه گردید. نهایتا اثر نانوذرات طلا بر ساختار آنزیم کراتینیناز با روش طیف سنجی فلورسانس، بررسی گردید. یافته ها: فعالیت آنزیم کراتینیناز در عدم حضور نانوذرات طلا U/ml ۶/۱۴  و در حضور نانوذرات طلا با غلظت های ۹۷/۱، ۹۴/۳، ۸۸/۷، ۸۲/۱۱، ۷۶/۱۵، ۷/۱۹و ۴/۳۹ نانوگرم بر لیتر به ترتیب U/ml ۱/۱۴، ۴/۱۲، ۲/۱۱، ۱/۱۰، ۴/۸، ۵/۷، ۷/۴ محاسبه گردید که نشان از کاهش فعالیت آنزیم کراتینیناز در حضور نانوذرات طلا دارد. از طرفی طیف سنجی فلورسانس آنزیم کراتینیناز در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا در طول موج تهییج ۲۹۵ نانومتر کاهش شدت فلورسانس در حضور نانوذرات طلا را نشان داد. نتیجه گیری: نانوذرات طلا باعث کاهش فعالیت آنزیم کراتینیناز شدند. همچنین نانوذرات طلا باعث کاهش شدت فلورسانس آنزیم کراتینیناز گردیدند که می تواند نشانگر تغییر در ریزمحیط اسیدآمینه تریپتوفان در ساختار آنزیم کراتینیناز باشد، در نتیجه استفاده از نانوذرات طلا گزینه مناسبی برای پایدارسازی فعالیت و ساختار آنزیم کراتینیناز جهت استفاده در کیت های تجاری نیستند. اهداف: استفاده از آنزیم کراتینیناز یک روش آنزیمی جهت سنجش میزان کراتین و کراتینین در مایعات بدن با هدف بررسی سلامت کلیه ها است. هدف از این تحقیق، بررسی اثر نانوذرات طلا بر فعالیت و پایداری آنزیم کراتینیناز به جهت استفاده در کیت های سنجش کراتین و کراتینین است. مواد و روش ها: در این مطالعه ابتدا باکتری E.Coli BL۲۱  حاوی وکتور تکثیری pET۲۸a حاوی ژن آنزیم کراتینیناز در محیط LB مایع کشت و سپس در دمای ۲۸ درجه القا بیان گردید. در ادامه پس از سونیکاسیون، تخلیص آنزیم  با کمک کروماتوگرافی تمایلی انجام شد. پس از تایید بیان با SDS-PAGE ، غلظت آنزیم بیان شده با روش برادفورد سنجش شد. در ادامه فعالیت آنزیم با روش رنگ سنجی در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا بررسی و مقایسه گردید. نهایتا اثر نانوذرات طلا بر ساختار آنزیم کراتینیناز با روش طیف سنجی فلورسانس، بررسی گردید. یافته ها: فعالیت آنزیم کراتینیناز در عدم حضور نانوذرات طلا U/ml ۶/۱۴  و در حضور نانوذرات طلا با غلظت های ۹۷/۱، ۹۴/۳، ۸۸/۷، ۸۲/۱۱، ۷۶/۱۵، ۷/۱۹و ۴/۳۹ نانوگرم بر لیتر به ترتیب U/ml ۱/۱۴، ۴/۱۲، ۲/۱۱، ۱/۱۰، ۴/۸، ۵/۷، ۷/۴ محاسبه گردید که نشان از کاهش فعالیت آنزیم کراتینیناز در حضور نانوذرات طلا دارد. از طرفی طیف سنجی فلورسانس آنزیم کراتینیناز در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا در طول موج تهییج ۲۹۵ نانومتر کاهش شدت فلورسانس در حضور نانوذرات طلا را نشان داد. نتیجه گیری: نانوذرات طلا باعث کاهش فعالیت آنزیم کراتینیناز شدند. همچنین نانوذرات طلا باعث کاهش شدت فلورسانس آنزیم کراتینیناز گردیدند که می تواند نشانگر تغییر در ریزمحیط اسیدآمینه تریپتوفان در ساختار آنزیم کراتینیناز باشد، در نتیجه استفاده از نانوذرات طلا گزینه مناسبی برای پایدارسازی فعالیت و ساختار آنزیم کراتینیناز جهت استفاده در کیت های تجاری نیستند.

Keywords:

Creatininase , Expression , Gold nanoparticles , Colorimetry , Fluorescence spectroscopy , Iau Science. , کراتینیناز , بیان , نانوذرات طلا , رنگ سنجی , طیف سنجی فلورسانس Iau Science.