جداسازی، کلونینگ و بیان ژن فاکتور VII انعقادی نوترکیب انسانی در رده سلولی CHO

جداسازی، کلونینگ و بیان ژن فاکتور VII انعقادی نوترکیب انسانی در رده سلولی CHO راحله حلبیان۱، ناصر شاگردی اسماعیلی۲، آرزو اوودی۲، ناصر مسروری۳، دکتر ناصر امیری زاده۴، دکتر کامران موسوی حسینی۵، دکتر احمد قره باغیان۶، دکتر حوری رضوان۷، دکتر محمد علی جلیلی۸، دکتر مهریار حبیبی رودکنار۹ چکیده سابقه و هدف فاکتور VII ، یک گلیکوپروتئین پلاسمایی است که در آبشار انعقادی تشکیل فیبرین، شرکت دارد. فاکتور VII در مسیر انعقادی نقش مهمی داشته و آغازگر مسیر خارجی انعقاد است. هدف اساسی این مطالعه جداسازی و کلونینگ فاکتور VII نوترکیب انسانی و بیان آن در رده سلولی یوکاریوتی CHO جهت بیان فاکتور VII نوترکیب(FVII) بود. مواد وروش ها مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. ابتدا cDNA ژن فاکتور VII از رده سلولی کبد انسان(HepG۲) جدا شده و در وکتور(+) ۱/۳ pcDNA کلون شده سپس وکتور نوترکیب به داخل سلول های CHO ترانسفکت شد. در نهایت، یک کلون سلولی که به طور پیوسته فاکتور VII را بیان می کند تثبیت شد. بیان فاکتور VII نوترکیب توسط روش های RT-PCR ، الایزا، SDS-PAGE و وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت. هم چنین تایید فعالیت بیولوژیکی فاکتور VII نوترکیب توسط آزمایش PT و ایجاد لخته در پلاسمای فاقد فاکتور VII صورت گرفت. یافته ها نتایج به دست آمده نشان دهنده کلونینگ و بیان موفقیت آمیز ژن فاکتور VII بود. پس از ۳ هفته کشت سلول های CHO در حضور جنتیسین، کلون سلول های پایدار به دست آمد. نتایج آزمایش های RT-PCR ، الایزا، SDS-PAGE و وسترن بلات حاصل از کلون ها، نشان دهنده بیان این پروتئین در رده سلولی CHO بود. کاهش ۳ الی ۴ برابری در زمان انعقاد نشان دهنده وجود فعالیت بیولوژیکی فاکتور VII نوترکیب بیان شده بود. نتیجه گیری سالانه حدود ۴۰۰۰ الی ۶۰۰۰ ویال(۳۳۶۰۰ تا ۵۰۴۰۰ میلی گرم) از این فرآورده وارد کشور می شود که دولت را متحمل هزینه بسیار بالایی می کند. بنابراین تولید فاکتور VII نوترکیب با استفاده از فناوری DNA نوترکیب در سطح آزمایشگاهی، می تواند اولین گام در راه فایق آمدن بر مشکلات فوق باشد.

Keywords:

Hemophilia , rFVIIa , CHO , Transfection , هموفیلی , فاکتور VII نوترکیب , CHO , ترانسفکشن