جداسازی، همسانه سازی و بیان ژن RNA پلیمراز باکتریوفاژ T۷ در باکتری E. coli به منظور تولید تجاری

مقدمه: آنزیم RNA پلیمراز باکتریوفاژ T۷، در رونویسی و بیان پروتئین های نوترکیب استفاده می شود. این آنزیم به فاکتور دیگری برای شناسایی پیشبر نیاز نداشته، بسیار اختصاصی عمل می کند و فقط ژن های تحت کنترل پیشبر T۷ را بیان می-نماید. این ویژگی ها موجب شده است که تولید آنزیم T۷ RNA پلیمراز در بیوتکنولوژی بسیار پر اهمیت باشد.مواد و روشها: در این تحقیق، برای تولید انبوه و کم هزینه این آنزیم، سویه باکتریوفاژ T۷ به عنوان الگو مورد استفاده قرار گرفت. واکنش PCR با استفاده از آغازگر های اختصاصی که حاوی سایت برشی برای آنزیم های BamHI و EcoRI بود انجام گرفت. پس از الکتروفورز محصول PCR، ژن تکثیر شدهT۷ RNA پلیمیراز و پلاسمید pGEX۲TK توسط این آنزیم ها برش داده شدند و پس از خالص سازی، واکنش لیگاسیون بین آن ها صورت گرفت. پلاسمید نوترکیب pGEX-T۷RNAPol با الکتروپوراسیون به باکتری E. coli منتقل شد. گزینش باکتری های حاوی پلاسمید نوترکیب به کمک PCR انجام گرفت. نتایج: پس از تایید پلاسمید حاصل، با برش آنزیمی و همچنین با PCR، توالی یابی آن انجام و درستی آن مطابق توالی ثبت شده در NCBI تایید شد. پلاسمید نوترکیب به منظور بیان پروتئین مورد نظر به باکتری E. coli سویه Rosetta منتقل شد. کلنی حاوی پلاسمید انتخاب وکشت شد. بیان پروتئین با القای IPTG در باکتری صورت گرفت و پس از استخراج به کمک SDS-PAGE تایید شد. این تحقیق پیش نیاز تولید تجاری و انبوه آنزیم T۷ RNA پلیمراز می باشد که پس از بهینه سازی بیان و خالص سازی پروتئین، تولید تجاری و بومی آن انجام خواهد شد.

Keywords:

آنزیم T۷ RNA پلیمراز , باکتریوفاژ T۷ , پروتئین نوترکیب , رونویسی , سیستم بیانی