تاثیر اندازه ریزنمونه بر تولید زیست توده و ویژگی های کالوس در کشت درون شیشه ای سرخدار اروپایی (Taxus baccata L.) و اقیانوس آرام (T. brevifolia Nutt.)

سابقه و هدف:پاکلی تاکسل یکی از پرمصرف ترین داروها در درمان سرطان است که در مقادیر بسیار کم (۰۱/۰ – ۰۳/۰ درصد وزن خشک) در پوست درختان نادر گونههای Taxus وجود دارد. امروزه موفقیت در کشت و تولید کالوسهای با کمیت و کیفیت در شرایط درون شیشه ای به منظور تولید حداکثری متابولیت های ثانویه دارویی و جلوگیری از انقراض گونههای گیاهی ارزشمند از اهمیت ویژهای برخوردار است. در این راستا، اندازه ریزنمونه کشت بافتی به دلیل تعیین توانایی بازتولیدی، تاثیر قابل ملاحظه‎ای بر میزان زیست توده کالوس و کیفیت آن دارد. از این رو، این پژوهش با هدف معرفی اندازه بهینه ریزنمونه های ساقه دو گونه سرخدار اروپایی و اقیانوس آرام در تولید کالوس با کمیت و کیفیت بیشتر انجام شد.مواد و روش ها در این تحقیق، از بافت ساقه دو گونه سرخدار Taxus baccata و T. brevifolia به عنوان ریزنمونه برای کشت بافت و تولید کالوس استفاده شد. ریزنمونههای ساقه هر دو گونه سرخدار پس از حذف قسمت انتهایی برگ ها، به صورت مجزا در پنج گروه با اندازه های ۲–۵/۱، ۵/۲–۲، ۳–۵/۲، ۵/۳–۳ و ۴–۵/۳ سانتیمتر تهیه شدند. کلیه ریزنمونهها پس از ضدعفونی با اتانول (۷۰ درصد)، هیپوکلریت سدیم (۵/۱ درصد) و آنتیبیوتیک سفوتاکسیم (۲۰۰ میلیگرم در لیتر)، روی محیط کشت B۵ جامد کشت و در اتاق رشد در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد و تاریکی نگهداری شدند. صفات مورد مطالعه شامل میزان زیست توده کالوس تولیدی به تفکیک گونه و اندازه ریزنمونه، ۲۸ روز پس از کشت ریزنمونهها ارزیابی شد. همچنین ویژگیهای مورفولوژیک کالوس های حاصل از هر گونه شامل نوع بافت کالوس با سه ساختار پنبه ای، نرم و مخلوط (ترکیبی از پنبه ای و نرم)، رنگ کالوس شامل سفید، قهوه ای و مخلوط (ترکیبی از سفید و قهوه ای) بررسی گردید. شدت ترشح ترکیبات فنولی براساس شدت رنگ در محیط کشت از صفر تا پنج (فاقد، خیلی کم، کم، متوسط، زیاد و خیلی زیاد) امتیازدهی شد. آزمایش به صورت فاکتوریل با دو عامل گونه در دو سطح و اندازه ریزنمونه در پنج سطح در قالب طرح پایه کاملا تصادفی اجرا شد. تجزیه آماری با استفاده از روشهای تجزیه واریانس و مقایسه میانگین با آزمون دانکن برای داده های کالوس زایی و آزمون کایاسکور برای داده های ترکیبات فنولی انجام شد. همچنین از همبستگی پیرسون به منظور ارزیابی ارتباط بین اندازه ریزنمونه و زیست توده و ترکیبات فنولی استفاده شد.یافته هابراساس نتایج، کالوس های حاصل از ریزنمونه های با طول کمتر از ۵/۲ سانتی متر در گونه T. brevifolia دارای ۳۳% وزن تر بیشتری در مقایسه با T. baccata بود. افزایش طول ریزنمونه از ۲–۵/۱ به ۳–۵/۲ سانتی متر سبب افزایش ۶/۲ برابری زیست توده کالوس گونه  T. baccataو ۵/۱ برابری در T. brevifolia شد. ترشح ترکیبات فنولی نیز در ریزنمونه های با طول کمتر از ۵/۲ سانتی متر در گونه  T. brevifolia۱۴ درصد کمتر از T. baccata مشاهده شد. با افزایش طول ریزنمونهها به ۳–۵/۲، ۵/۳–۳ و ۴– ۵/۳ سانتی متر ترشح ترکیبات فنولی به ترتیب ۴، ۶ و ۱۵% در T. brevifolia در مقایسه با T. baccata بیشتر بود. نتایج نشان داد، کالوس های حاصل از ریزنمونه های T. baccata و T. brevifolia به ترتیب دارای ۸۲ و ۲۷% بافت پنبه ای، ۲ و ۵۲% بافت نرم و ۱۶ و ۲۱%  بافت مخلوط بودند. بیشترین درصد کالوس های سفید رنگ با ۶۳% کالوس به T. baccata تعلق داشت و بافت مخلوط و قهوه ای به ترتیب در %۳۰ و ۷% از کالوسها مشاهده شد. در حالی که تنها ۳۷% از کالوس های  T. Brevifoliaسفید رنگ بودند و ۳۳% و ۳۰% به ترتیب مخلوط و قهوه ای رنگ بودند. نتایج همچنین حکایت از وجود همبستگی متوسط ۵۷/۰ و ۴۰/۰ به ترتیب بین اندازه ریزنمونه با زیست توده تولیدی در گونه T. baccata و T. brevifolia از یکسو و همبستگی ضعیف ۲۳/۰ و ۲۵/۰ بین اندازه ریزنمونه با شدت ترشح ترکیبات فنولی در دو گونه مورد مطالعه داشت. نتیجه گیرینتایج نشان داد امکان افزایش معنیدار زیست توده کالوس با کمترین میزان ترکیبات فنولی از ریزنمونههای ساقه دو گونه سرخدار با افزایش طول معین در اندازه ریزنمونه میسر است. همچنین با در نظر گرفتن زیست توده تولیدی و ویژگی های کالوس مشخص شد که طول ۵/۲–۲ سانتی متر به دلیل تولید زیست توده کالوس بیشتر از یکسو و ترشح ترکیبات فنولی کمتر از سوی دیگر به عنوان بهینه اندازه ریزنمونه ساقه در کشت بافت دو گونه مورد مطالعه پیشنهاد شد.

Keywords:

پاکلی تاکسل , ترشحات فنولی , کشت بافت , محیط کشت B۵