بیان، تخلیص و تعیین خصوصیات آنزیم پرولین دهیدروژناز از POS-F84 Pseudomonas putida

زمینه و هد ف: آنز یم پرولین دهیدروژناز (EC 1.5.1.2 ) نقش مهمی را در مسیر متابولیسم پرولین به گلوتامات ایفاء مینماید. کاربرد این آنزیم در تشخیص بیماریهای متابولیک مرتبط با نقص پرولین می باشد . هدف از این تحقیق، جداسازی، تولید فرم نوترکیب و تعیین خصوصیات پرولین دهیدروژناز از Pseudomonas putida جداسازی شده از نمونه خاک ایران بود. روشها: پس از بررسی توالی ژنهای مشابه و طراحی پرایمر بر اساس نواحی حفاظت شده، ژن آنزیم مذکور با استفاده از واکنش زنجیره های پلیمراز (PCR ) تکثیر شد. محصول PCR پس از تایید توسط آنالیز برش آنزیمی و توالی یابی، در حامل بیانی pET-23a کلون گردید و سپس سازه ساخته شده به داخل باکتری E. coli BL21 (DE3) pLysS ترانسفورم شد. آنزیم نوترکیب تولید شده بوسیله توالی یابی و سنجش فعالیت آنزیمی مورد تایید نهایی قرار گرفت و با کمک کروماتوگرافی تمایلی تخلیص شد .نتایج: بهترین شرایط برای بیان پرولین دهیدروژناز نوترکیب با IPTG و 1 میلی مولار در دمای 23 درجه سانتی گراد و زمان القاء 5 ساعت به دست آمد و فعالیت آنزیم تولید شده، U/ml 900 محاسبه شد. ترادف نوکلئوتیدی آنزیم، پروتئینی به طول 345 آمینواسید را کد می نمود و وزن مولکولی هر زیر واحد توسط الکتروفورز SDS-PAGE، 41 کیلو دالتون تخمین زده شد. بحث و نتیجه گیری: در مجموع، ژن آنزیم پرولین دهی دروژناز از سویه P. putida جداسازی و کلون شد و فرم نوترکیب آن در E. coli بیان گردید. تحقیق انجام شده اولین گزارش از تولید آنزیم نوترکیب پرولین دهیدروژناز جداسازی شده از سویه مذکور می باشد.

Keywords:

کلونینگ , پرولین دهیدروژناز , Pseudomonas putida