کلون بیان، خالص سازی و تعیین ویژگیهای بیوشیمیایی، بیوفیزیکی آنزیم پروتیین دی سولفید ایزومراز از باکتری باسیلوس سابتیلیس DR8806

تاخوردگی صحیح پروتیینها یکی از مهمترین عوامل و مشکلات در مسیر ساخت پروتیینهای نوترکیب است. وجود پیوندهای دی سولفیدی یکی از مهمترین عواملی است که منجر به تاخوردگی نامناسب پروتیینها میگردد در حالیکه تشکیل پیوندهای دی سولفیدی صحیح برای فعالیت بیولوژیک بسیاری از پروتیینها ضروری است. پروتیین دی سولفید ایزومراز اولین و مهمترین کاتالیست تاخوردگی پروتیینها است که کاهش، اکسایش و ایزومریزاسیون پیوندهای دی سولفیدی را کاتالیز میکند. در این تحقیق ژن کد کنندهی پروتیین دی سولفید ایزومراز از سویهای از باسیلوس سابتیلیس که از چمشه آبگرم در کرمان جداسازی شده بود، به صورت فیوز شده با گلوتاتیون s ترانسفراز درون وکتور pGEX4t کلون و در باکتری اشریشیاکلای TOP10 بیان شد. خالص سازی با استفاده از ستون کروماتوگرافی GST انجام شد و بعد از جدا شدن تگ فعالیت مخصوص آنزیم u/mg1227 بود. توالی آنزیم دارای یک چارچوب خوانش با 618 جفت باز بود که 206 اسیدآمینه را کد میکند و از لحاظ ساختاری 5% متفاوت تر از تمامی پروتیین های تا به حال گزارش شده است. وزن مولکولی آنزیم خالص شده 26 / 23 کیلو دالتون بود. فعالیت آنزیم در حضور یونهای Co+2 و Mn+2 افزایش یافت در حالیکه فعالیتش در حضور یونهای Ag + و Zn+2 کاهش یافت. Ba+2 و Ca+2 هیچ اثری روی فعالیت آنزیم نداشتند. بعضی از مهارکننده های شناخته شده برای پروتیین دی سولفید ایزومراز آنزیم را مهار میکردند و برخی دیگر اثری بر آن نداشتند. آنزیم در محدودهی وسیعی از 4/5-10( pH ( و دما ) 85 20- درجه سانتیگراد( فعال بود و بهینه pH آن 5/ 5 و دمای بهینه فعالیت 65 درجه بود. تاکنون گزارشی مبنی بر وجود پروتیین دی سولفید ایزومراز با ویژگی پایداری در محدوده ی وسیعی از pH و دما ارایه نشده است در نتیجه این آنزیم میتواند کاربردهای بالقوه فراوانی در صنایع مربوطه داشته باشد.

Keywords:

باسیلوس سابتیلیس , بیان , پروتیین دی سولفید ایزومراز , کلونینگ