بررسی تنوع ژنتیکی فیتوپلاسماهای عامل جاروک لیموترش در ایران با استفاده از ‭PCR-RFLP ‬و آنالیز توالی ژنهای پروتیین ریبوزومی و ‭S rDNA16‬

بیماری جاروک لیمو ترش ‭(Lime witches-broom) ‬یکی از مخربترین بیماریهای فیتوپلاسمایی در ایران است که توسط ‭Candidatus Phytoplasma aurantifolia ‬ایجاد می گردد. در این تحقیق به منظور بررسی تنوع ژنتیکی فیتوپلاسمای عامل جاروک لیموترش و همچنین بررسی آلودگی احتمالی مرکبات و سایر میزبانهای علفی در استانهای آلوده هرمزگان، سیستان-بلوچستان و کرمان در طی سالهای ‮‭86-87‬ بازدیدهایی از باغات آلوده صورت گرفت. علایم بیماری در درختان لیموترش اغلب به صورت زردی، ریزبرگی، کاهش فاصله میانگره ها، ظهور شاخه های جارویی در درختان آلوده بود. برای تعیین تفاوتهای احتمالی جدایه های فیتوپلاسمایی از مناطق مختلف از روشهای مبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز ‭(PCR) ‬و ‭PCR-RFLP ‬با کاربرد ترکیبی از نواحی ژنی مختلف استفاده شد. در این تحقیق ‮‭125‬ نمونه مورد بررسی قرار گرفت. پس از استخراج ‭DNA ‬کل ، ژنوم جدایه ها با استفاده از جفت آغازگر P1‭/P‬7 (واکنش دور اول) و R‮‭16‬F2‭/R‬‮‭16‬R2 ( واکنش‭Nested-PCR ( ‬تکثیر گردید. قطعه ‮‭1250‬ جفت باز تکثیر شده با آغازگر R‮‭16‬F2‭/R‬‮‭16‬R2 با استفاده از آنزیمهای برشی ‭HaeIII‬، ‭EcoRI ‬و ‭MspI ‬تجزیه و تحلیل ‭RFLP ‬شدند. مقایسه قطعات ‭DNA ‬بریده شده در جدایه های انتخاب شده از مناطق مختلف مشخص نمود که محلهای برش آنزیمی در ‭DNA ‬فیتوپلاسمای عامل جاروک لیمو ترش مناطق مختلف کاملا مشابه هستند. به منظور بررسی دقیق تر روابط فیلوژنتیکی فیتوپلاسمای عامل جاروک لیموترش از آغازگرهای طراحی شده بر اساس ژن پروتیین ریبوزومی‭rpF‬1‭/rpR‬1 و ژن فاکتور طویل سازی ‭rTuf‬1‭/fTuf‬1 استفاده گردید. ولی محدود بودن واکنشهای مثبت ‭PCR ‬نمونه ها و وجود باندهای تکثیر شده ضعیف با این آغازگر مانع استفاده از این آغازگر برای بررسی تنوع ژنتیکی شد. با توجه به کارایی بالای ناحیه بین ژنی در بررسی تنوع ژنتیکی، در ادامه کار جدایه های ‭LWB‬،‮‭12‬ ‭LWB‬،‮‭25‬ ‭LWB‬،‮‭44‬ ‭LWB‬،‮‭97‬ ‭LWB‬‮‭119‬ از مناطقی با فاصله جغرافیایی دورتر، با استفاده از جفت آغازگر ‭fP‬3‭/m‬‮‭23‬‭Sr ‬تحت واکنش زنجیره ای پلیمراز قرار گرفتند. تعیین توالی قطعه ‮‭340‬ جفت باز تکثیر شده توسط این آغازگر و مقایسه توالی های بدست آمده از این جدایه ها با سایر توالی های موجود در بانک اطلاعات ژنی ‭NCBI ‬نشان داد که قطعه توالی یابی شده جدایه های جمع آوری شده از استانهای مذکور صد در صد با یکدیگر شباهت دارند و در گروه ‭Peanut Witches-broom ‬قرار گرفتند. به دلیل مشاهده عدم تنوع بین جدایه های جاروک لیموترش با استفاده از نواحی ژنی ذکر شده، از ژن‭DNA polymerase beta III chain ‬استفاده شد. قطعه ‮‭650‬ جفت باز تکثیر شده توسط جفت آغازگر ‭pTBB‬‮‭14‬‭F/pTBB‬‮‭14‬‭R ‬طراحی شده از ناحیه ژنی ‭DNA polymerase beta III chain ‬تعیین توالی نوکلیوتیدی شدند. نتایج تعیین توالی نشان داد که جدایه های جاروک لیموترش ‮‭99-100‬ درصد با یکدیگر شباهت دارند. در این تحقیق نتایج حاصل از ‭PCR-RFLP ‬با نتایج تعیین توالی نوکلیوتیدی نواحی ژنی مختلف تطابق داشت و جدایه های مورد مطالعه در گروه ‭Peanut witches-broom ‬قرار گرفتند. در تحقیق حاضر مرکباتی غیر از لیموترش نظیر پرتقال و نارنگی، گیاهان علفی و علف های هرز از جمله یونجه، شبدر، کنجد،خار شتر، علف شور، تاج ریزی، بارهنگ، پیچک صحرایی، تاج خروس، آفتابگردان، خاکشیر، گل جعفری و پنبه به عنوان میزبانهای احتمالی از نظر آلودگی به فیتوپلاسما مورد آزمایش قرار گرفتند که از بین آنها آلودگی طبیعی کنجد به اثبات رسید. علایم بیماری در کنجد به صورت گل سبزی، گل عقیمی و بدشکلی ساقه ظاهر گردید که بعد از ‭PCR ‬با آغازگرهای P1‭/P‬7 ‭( PCR ‬دور اول) و R‮‭16‬F2‭/R‬‮‭16‬R2 ( واکنش دور دوم ) قطعه ‮‭1250‬ نوکلیو تیدی تکثیر شد که بر اساس علایم بیماری و واکنش مثبت در مقابل ‭PCR ‬و تعیین توالی نوکلیوتیدی کنجدآلوده به فیتوپلاسما تشخیص داده شد و در گروه ‭Peanut witches-broom ‬قرار گرفت. در تحقیق حاضر مرکباتی غیر از لیموترش نظیر پرتقال و نارنگی، گیاهان علفی و علف های هرز از جمله یونجه، شبدر، کنجد، خار شتر، علف شور، تاج ریزی، بارهنگ، پیچک صحرایی، تاج خروس، آفتابگردان، خاکشیر، گل جعفری و پنبه به عنوان میزبانهای احتمالی از نظر آلودگی به فیتوپلاسما مورد آزمایش قرار گرفتند که از بین آنها آلودگی طبیعی کنجد به اثبات رسید. علایم بیماری در کنجد به صورت گل سبزی، گل عقیمی و بدشکلی ساقه ظاهر گردید که بعد از ‭PCR ‬با آغازگرهای P1‭/P‬7 ‭(PCR ‬دور اول) و R‮‭16‬F2‭/R‬‮‭16‬R2 ( واکنش دور دوم ) قطعه ‮‭1250‬ نوکلیو تیدی تکثیر شد که بر اساس علایم بیماری و واکنش مثبت در مقابل ‭PCR ‬و تعیین توالی نوکلیوتیدی کنجدآلوده به فیتوپلاسما تشخیص داده شد و در گروه ‭Peanut witches-broom ‬قرار گرفت. مرکباتی نظیر پرتقال و نارنگی، گیاهان علفی و برخی از علفهای هرز که فاقد علایم و یا دارای علایم زردی و ریز برگی بودند در واکنش با ‭PCR ‬هیچ قطعه ای را تکثیر نکردند. واژه های کلیدی: فیتوپلاسما، جاروک لیموترش، واکنش زنجیره ای پلیمراز‭(PCR)‬، تعیین توالی نوکلیوتیدی، میزبانهای علفی