مقایسه کارآیی روش های پی سی آر معمولی، nested-PCR، real-time PCR و تکثیر هم دمای وابسته به حلقه(LAMP) در ردیابی عامل بیماری هوآنگ لونگ بینگ مرکبات در ایران*

بیماری هوانگ لونگ بینگ (HLB) یا میوه سبز مرکبات یکی از بیماری های خطرناک مرکبات در دنیا است که اخیرا از ایران نیز گزارش شده است. برای انجام مدیریت بهینه بیماری HLB، ردیابی به موقع و سریع بیماری در باغ های مرکبات امری اجتناب ناپذیر است. به منظور مقایسه کارآیی روش های پی سی آر معمولی، nested-PCR، real-time PCR و تکثیر هم دمای وابسته به حلقه (Loop-mediated Isothermal Amplification) در ردیابی Candidatus Liberibacter asiaticus، عامل بیماری HLB در ایران، از نمونه های برگ مربوط به یک درخت پرتقال آلوده و یک درخت سالم استخراج دی ان ای کل انجام شد. سپس در مقادیر مختلف  دی ان  ای کل ( از ۱۰۰ نانوگرم تا ۱/۰ فمتوگرم) از گیاه آلوده و سالم ردیابی عامل بیماری با آزمون پی سی آر معمولی (با چهار آغازگر مختلف)، nested-PCR  (با سه مجموعه آغازگر مختلف)،  real-time PCR (با یک جفت آغازگر) و LAMP (با دو مجموعه آغازگر مختلف) انجام و حساسیت، اختصاصیت و صحت برای هر روش بررسی شد. کلیه روش ها، به جز پی سی آر معمولی با آغازگر F۱/R۱ (۹۰ درصد)، در مقادیر ۱۰۰، ۱۰ و ۱ نانوگرم  از دی ان ای کل با حساسیت ۱۰۰ درصد عامل بیماری را ردیابی کردند. روش پی سی آر معمولی (با هر کدام از چهار آغازگر) با مقدار ۱۰۰ پیکوگرم DNA، به طور میانگین عامل بیماری را در حدود ۳۰ درصد ردیابی نمود ولی در مقادیر ۱ پیکوگرم تا ۱/۰ فمتوگرم نتوانست عامل بیماری را ردیابی نماید. روش LAMP تا میزان ۱۰ پیکوگرم از دی ان ای کل را با حساسیت ۲۰ تا ۳۰ درصد ردیابی نمود ولی در مقادیر پایین تر از این مقدار (۱ پیکوگرم و کمتر از DNA)، با هرکدام از دو مجموعه آغازگر قادر به ردیابی عامل بیماری نبود. حساسیت روش LAMP شبیه یا در برخی مقادیر DNA اندکی بیشتر از پی سی آر معمولی بوده ولی سریع تر و ارزان تر از آن است. روش nested-PCR (با هر سه جفت آغازگر برای دور دوم)، عامل بیماری را با حساسیت ۱۰۰ درصد تا مقدار ۱ پیکوگرم دی ان ای کل ردیابی کرده و در کمترین مقدار دی ان ای کل یعنی ۱/۰ فمتوگرم نیز با حساسیت حدود ۳۰ درصد عامل بیماری را ردیابی نمود. روش real-time PCR تا ۱۰ فمتوگرم DNA، عامل بیماری را با حساسیت ۱۰۰ درصد و در مقادیر ۱ و ۱/۰ فمتوگرم DNA، عامل بیماری را با حساسیت ۹۰ درصد ردیابی نمود و بیشترین حساسیت را نشان داد؛ با وجود این، از عیوب این روش وقوع بیشتر نتایج مثبت کاذب نسبت به سایر روش ها می باشد. براساس نتایج به دست آمده به دلیل حساسیت بالای روش های real-time PCR و nested-PCR در ردیابی عامل بیماری HLB، استفاده از این روش ها در ردیابی درختان آلوده به ویژه در مناطقی که بیماری بتازگی وارد شده یا خطر آلودگی وجود دارد در کنار سایر روش های ردیابی پیشنهاد می شود. در بسیاری از شرایط استفاده از روش nested-PCR با توجه به کمتر بودن نتایج مثبت کاذب و ارزان تر بودن نسبت به روش real-time PCR می تواند انتخاب مناسب تری برای ردیابی بیماریHLB  باشد.  

Keywords:

ردیابی بیمارگر , Candidatus Liberibacter asiaticus , میوه سبز مرکبات , LAMP