بهینه سازی و ارائه دستورالعمل استخراج و باززایی پروتوپلاست سیب زمینی و تراریختی آن

هدف: ویژگی های منحصر بفرد پروتوپلاست های گیاهی، آن ها را به ابزاری قدرتمند برای محققین، جهت مطالعه تغییرات ژنتیکی سلولی تبدیل کرده است. مهمترین پیش­نیاز استفاده از پروتوپلاست ها، توانایی استخراج ساده در مقادیر بالا، کشت و باززایی آن ها جهت تشکیل کلونی سلولی و تولید گیاه است. معمول ترین روش استخراج پروتوپلاست از بافت های گیاهی، روش آنزیمی است. غلظت و ترکیب آنزیم ها و مراحل جداسازی و کشت، از عوامل کلیدی استخراج پروتوپلاست­ می باشد. هدف این تحقیق، بررسی اثر فاکتورهای مذکور بر روی پروتوپلاست های گیاهان درون شیشه­ای سیب زمینی (Solanum tuberosum L.) و معرفی روشی کارا و مناسب برای استخراج، تراریختی و کالوس زایی/باززایی از این گیاه است. مواد و روش ها: برای جداسازی پروتوپلاست سیب زمینی رقم رایج تجاری آگریا، تیمارهای مختلف غلظت آنزیم های سلولاز و مسروزیم، مدت نگهداری در محلول آنزیمی و مراحل جداسازی بر روی بافت­ برگ، ساقه و بخش های هوایی گیاهچه های درون شیشه­ای و اثر غلظت هورمن های مختلف برکشت و باززایی پروتوپلاست مورد بررسی قرار گرفت. پس از جداسازی، کارآیی تراریختی پروتوپلاست ها به واسطه­ی PEG ۴۰۰۰ با استفاده از ناقل pBin۶۱-GFP ارزیابی شد. نتایج: بهترین نتایج از ریزنمونه های برگی و بالاترین تعداد پروتوپلاست (۱۰۶ × ۲ پروتوپلاست بر میلی­لیتر)، پس از ۱۶ ساعت نگهداری در محلول آنزیمی (حاوی ۱ درصد سلولاز و ۲/۰ درصد مسروزیم) از بافت های مزوفیل برگ حاصل شد. کارآیی تراریختی پروتوپلاست ها به­واسطه­ی PEG با غلظت ۴۰ درصد و مدت زمان ۳۰ دقیقه ،۵۰ درصد بود. بهترین تیمار محیط کشت برای القای کالوس زایی، محیط MS حاوی ۵ میلی گرم بر لیتر NAA و ۱/۰ میلی گرم بر لیتر BAP بدست آمد که در این تیمار هورمونی، ۱۰۰ درصد پروتوپلاست ها بعد از حدود یک ماه کالوس تشکیل دادند. بهترین تیمار باززایی از کالوس ترکیب هورمونی ۲ میلی گرم برلیتر Zeatin با ۱/۰ میلی گرم بر لیتر GA۳ به­همراه ۰۱/۰ میلی گرم بر لیتر NAA با راندمان ۸۶ درصد بود. نتیجه گیری: بر اساس نتایج حاصل، دستورالعمل استخراج پروتوپلاست و انتقال ژن توصیف شده در این تحقیق برای مهندسی ژنتیک، انتقال و بیان ژن در گیاه سیب زمینی کارآیی لازم را دارد.

Keywords:

پروتوپلاست , پلی اتیلن گلیکول , سلولز , مسروزیم , مهندسی ژنتیک