طراحی و بهینه سازی واکنش زنجیر های پلیمراز چندگانه جهت تکثیر

زمینه و هدف: آنتی بادی ها در بسیاری از حوزه های تشخیص و درمان مورد استفاده قرار می گیرند. آنتی بادی های کاملا انسانی به دلیل عدم برانگیختن پاسخ ایمنی در بدن بسیار مورد توجه قرار دارند. این مطالعه با هدف طراحی و بهینه سازی واکنش زنجیر های پلیمراز چندگانه جهت تکثیر ژن های آنتی بادی انسانی علیه توکسوئید کزاز انجام شد. روش بررسی: پس از خونگیری از انسان ایمن شده با توکسوئید کزاز و جداسازی لمفوسیت ها، RNA استخراج و cDNA ساخته شد. طی دو واکنش PCR چندگانه و با استفاده از ۱۴ جفت پرایمر، همه تنوع ژن های ناحیه متغیر زنجیره های سبک (کاپا) و سنگین آنتی بادی تکثیر شد. واکنش PCR جهت اتصال قطعات VH و VL به صورتScFv  و واکنش  Semi Nested PCR جهت افزودن جایگاه برش آنزیم محدودالاثر به دو انتهای قطعه انجام شد. یافته ها: در انجام دو واکنش Multiplex PCR ، دو قطعه VH و VL به ترتیب به اندازه های bp۴۱۰ و ۶۸۰ تکثیر شد. با واکنشOverlap Extension PCR، دو قطعهVH  و VL به صورت ScFv به هم متصل و قطعه bp۱۰۷۰ به دست آمد. در نتیجه انجام واکنش Semi Nested PCR، جایگاه برش به دو انتهایScFv  اضافه شد. نتیجه گیری: با انتخاب مجموعه پرایمر مناسب و بهینه سازی عوامل موثر در Multiplex PCR، می توان با دو واکنشMultiplex PCR  جداگانه به جای چند واکنش Uniplex، همه تنوع های ژن های آنتی بادی به دست آمده از میان cDNA تام لمفوسیت انسانی را تکثیر و جداسازی نمود، لذا می توان تنها با استفاده از دو واکنش Multiplex PCR، تمامی تنوع های ژنتیکی آنتی بادی انسانی را به صورت قطعات VH و VL از خون فرد ایمن شده با توکسوئید کزاز تکثیر کرد.

Keywords:

Recombinant Antibody , Tetanus Toxoid , Multiplex Polymerase Chain Reaction. , آنتی بادی نوترکیب , توکسوئید کزاز , واکنش زنجیر های پلیمراز چندگانه