کلونینگ، بیان، خالص سازی و ارزیابی آنزیم لیزواستافین نوترکیب با استفاده از سیستم کلونینگ pBAD

سابقه و هدف: استافیلوکوک اورئوس یک پاتوژن مهم بیمارستانی بوده و باعث ایجاد بیماری هایی همچون اندوکاردیت، استئومیلیت، پنومونی، سندرم شوک سمی و مسمومیت غذایی می گردد. امروزه استفاده بیش از حد و نامناسب از آنتی بیوتیک ها در درمان این بیماری ها باعث مقاومت این ارگانیسم به بسیاری از آنتی بیوتیک ها شده است. لیزواستافین به عنوان یک عامل موثر و اختصاصی در درمان عفونت های استافیلوکوکی محسوب می شود. هدف از این مطالعه تولید لیزواستافین نوترکیب با استفاده از سیستم کلونینگ pBAD می باشد. مواد و روش ها: در مرحله اول، ساخت پلاسمید نوترکیب pBAD با استفاده از سیستم pBAD/Thio-TOPO تحت عنوان pBADLys انجام گرفت. سپس به منظور بیان ژن لیزواستافین از آزمون Reverse Transcriptase PCR استفاده گردید. در مرحله بعد، بیان لیزواستافین نوترکیب در سیستم pBAD انجام شد که بیان پروتئین با ال-آرابینوز در غلظت نهایی ۲/۰ درصد القاﺀ گردید. سپس خالص سازی آنزیم با استفاده از ستون Ni-NTA agarose (Qiagene, Hilden, Germany) انجام گرفت و در نهایت بررسی فعالیت آنزیمی با استفاده از محیط مولر هینتون آگار و ایجاد هاله عدم رشد مورد بررسی قرار گرفت. یافته ها: با توجه به نتایج حاصل شده از PCR و تعیین توالی، پلاسمید نوترکیبpBAD با موفقیت ساخته شد. بیان پروتئین با استفاده از ال-آرابینوز در غلظت نهایی ۲/۰ درصد به خوبی القاﺀ و غلظت بسیار بالایی از آنزیم نوترکیب با استفاده از سیستم کروماتوگرافی ستونی نیکل حاصل گردید. لیزواستافین نوترکیب دارای فعالیت بسیار اختصاصی بر علیه استافیلوکوکوس اورئوس می باشد. استنتاج: آنزیم لیزواستافین نوترکیب حاصل شده با استفاده از سیستم بیانی pBAD با توجه به میزان حاصل شده بسیار مقرون به صرفه از نظر هزینه می باشد و همچنین با عملکرد اختصاصی بر روی استافیلوکوکوس اورئوس بسیار موثر است.

کلونینگ، بیان، خالص سازی و ارزیابی آنزیم لیزواستافین نوترکیب با استفاده از سیستم کلونینگ pBAD Keywords:

Lysostaphin , recombinant proteins , Staphylococcus , لیزواستافین , پروتئین نوترکیب , استافیلوکوک