همسانه سازی و بیان ناحیه کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E در باکتری E.coli

سابقه و هدف: باکتری های کلستریدیوم بوتولینوم هفت نوع نوروتوکسین تولید می کنند که تیپ های A، B، E و F منجر به بوتولیسم در انسان می شوند. یکی از روش های درمانی بوتولیسم می تواند از طریق مهار فعالیت آنزیمی ناحیه کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم توسط مهارکننده ها باشد. در این مطالعه، ناحیه کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E در وکتور بیانی pET۲۸a همسانه سازی و در باکتری میزبان E. coli سویه BL۲۱(DE۳) بیان شده است. مواد و روش ها: به منظور همانندسازی ناحیه مورد نظر، DNA ژنومی باکتری استخراج گردید. با استفاده از واکنش PCR توالی مورد نظر تکثیر شد. سپس محصول PCR در وکتور pGEM-T Easy وارد و وکتور نوترکیب به سلول های میزبان E. coli سویه DH۵α منتقل گردید. سپس با واکنش الحاق محصول همسانه سازی شده از وکتور pGEM-T Easy به وکتور بیانی pET۲۸a منتقل شد. در نهایت پلاسمید نوترکیب pET۲۸a به باکتری E. coli سویه BL۲۱(DE۳) انتقال داده شد. بیان ناحیه کاتالیتیک در شرایط استاندارد مورد مطالعه قرار گرفت. یافته ها: نتایج حاصل از برش آنزیمی و واکنش PCR بیانگر همانندسازی و زیر همانندسازی به ترتیب در وکتورهای pGEM-T Easy و pET۲۸a بود. نتایج تعیین توالی نیز صحت حضور توالی مورد نظر را تایید کرد. در نهایت بیان قطعه مورد مطالعه، با استفاده از ژل SDS-PAGE و آزمایش وسترن بلات تایید گردید. استنتاج: همسانه سازی توالی مورد مطالعه، به ترتیب در وکتورهای pGEM-T Easy و pET۲۸a با صحت کامل انجام گرفت. همچنین نتایج بیان و تایید محصول بیانی در باکتری E. coli BL۲۱(DE۳) بیانگر صحت بیان محصول مورد نظر بود.

Keywords:

Botulinum neurotoxin type E , catalytic domain , cloning , expression , نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E , ناحیه کاتالیتیک , همسانه سازی , بیان