کلونینگ آنزیم SSAT-1

اسپرمیدین / اسپرمین N1- استیل ترانسفراز (SSAT) آنزیمی است که از طریق استیله کردن پلی آمین‌ها در تنظیم میزان آنها در داخل سلول نقش دارد. محصولات استیله شده یا به خارج از سلول هدایت می‌شوند یا توسط استیل پلی آمین اکسیدازها اکسید می‌شوند. از آنجا که پلی آمین ها نقش اساسی در رشد طبیعی و نئوپلاستیک و تنظیم کانال های یونی ایفا می‌کنند پس می توان گفت که SSAT یک آنزیم کلیدی و مهم در این فرآیندهاست.مطالعات متعدد روی سلولهای سرطانی مختلف نشان داده که بیان SSAT در پاسخ به داروهای شیمی درمانی افزایش می‌یابد. هر چند بررسی تاثیر این افزایش بیان روی سلول های سرطانی مختلف اثرات متناقضی در بر داشته است به طوری که افزایش بیان این ژن در یک رده سلولی با کاهش شدت کارسینوژنز و در رده سلولی دیگر با افزایش شدت آن همراه بوده است. مکانیسم و چگونگی اثر این افزایش بیان کاملا شناسایی نشده است و هنوز ابهامات زیادی در این زمینه وجود دارد.اولین رویکرد در آنالیز عملکرد یک پروتئین شناسایی پروتئین های برهم کنش دهنده با آن است لذا به عنوان اولین گام کلونینگ این ژن به منظور بررسی محصول آن در مطالعات عملکردی در دستور کار قرار گرفت.به منظور انجام کلونینگ RNA تام سلول استخراج شد. پس از سنتز cDNA فرآیند تکثیر ژن یا PCR با استفاده ازpolymerase Pfu DNA صورت پذیرفت. توالی کد کننده (SSAT-1(560 bp داخل وکتور (+)pBluescriptSKII هضم شده با EcoRV قرار گرفت. پس از تعیین توالی و تایید صحت آن قطعه DNA داخل وکتور بیانی pQE-32 ساب کلون شد. سپس با استفاده از IPTG بیان پروتئین نوترکیب القا‌ شد و میزان بیان آن با SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار‌گرفت.

Keywords:

, SSAT , بیان ژن , کلونین