کلونینگ گلوتامات دکربوکسیلاز و سنجش فعالیت آنزیم

آنزیم گلوتامات دکربوکسیلاز یک آنزیم وابسته به پیریدوکسال فسفات می‌باشد که واکنش یرگشت ناپذیر دکربوکسیلاسیون ال گلوتامات به گاما آمینوبوتیریک اسید را کاتالیز می کند. گابا یک اسید آمینه غیر پروتئینی است که به عنوان یک نوروترانسمیتر عمده در بافت مغز پستانداران شناخته شده است. گابا دارای اثرات فیزیولوژیکی مشتمل بر انتقال عصبی، فعالیت کاهندگی فشار خون، ،اثرات مدری ، مهار دیابت و سرطان می باشد. باکتریهای اسید لاکتیک توانایی تولید گابا را دارند و گلوتامات دکربوکسیلاز مسئول تولید گابا در باکتریهای اسید لاکتیک می باشد. توالی ژنومی آنزیم گلوتامات دکربوکسیلاز از NCBI گرفته شد و پرایمرهای اختصاصی برای این ژن با استفاده از نرم افزار اولیگو6 طراحی شد. سپس DNA ژنومی لاکتوباسیلوس برویس را استخراج کرده و PCR انجام داده و باند مورد نظر پس از استخراج از ژل به وکتور PGEX-6p-2 الحاق شد و سپس وکتور نوترکیب وارد باکتری ای‌کولای XL1Blue وارد کرده و در محیط LB حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه گرماگذاری شد. سلول‌ها سانتریفوژ شده و عصاره سلولی برای سنجش فعالیت آنزیم گلوتامات دکربوکسیلاز به روش کلریمتریک با استفاده از بروموکرزول سبز به عنوان شناساگر به کار برده شد. این سنجش بر اساس تغییر رنگ بروموکرزول سبز به دلیل افزایش PH می باشد ، زیرا در طی فعالیت کاتالیزوری آنزیم گلوتامات دکربوکسیلاز پروتون مصرف می شود. این یک روش ساده و سریع برای سنجش فعالیت آنزیم گلوتامات دکربوکسیلاز و دیگر دکربوکسیلازهای آمینواسیدی است که در PH اسیدی فعال هستند. درنتیجه به دلیل آسان بودن و عدم نیاز به دستگاههایی مثل HPLC می توان از این روش برای سنجش فعالیت گلوتامات دکربوکسیلاز استفاده کرد و در نهایت گاما آمینوبوتیریک اسید را به صورت موثر و کارا تولید کرد.

Keywords:

گلوتامات دکربوکسیلاز , سنجش فعالیت , بروموکرزول سبز