جداسازی و بررسی خصوصیات باکتریوفاژهای لیتیک موثر جهت کنترل عفونت های حاصل از باکتری های کلبسیلا پنومونیه مقاوم به آنتی بیوتیک در شمال غرب ایران

سابقه و هدف: با ظهور باکتری های مقاوم به آنتی بیوتیک، یافتن مواد ضد میکروبی جایگزین موثر برای مبارزه با این باکتری ها اجتناب ناپذیر می باشد. باکتریوفاژ درمانی به عنوان یک رهیافت بیولوژیک دارای پتانسیل درمانی بالا اخیرا در این زمینه مورد توجه قرار گرفته است. این مطالعه با هدف جداسازی باکتریوفاژهای لیتیک علیه جدایه های بالینی کلبسیلا پنومونیه دارای مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی و ارزیابی خصوصیات زیستی و شکلی آن ها به عنوان کاندیداهایی برای فاژ درمانی، انجام پذیرفت. مواد و روش ها: در این مطالعه توصیفی- مقطعی، جدایه های بالینی به دست آمده از بیمارستان شهید مدنی شهر تبریز با استفاده از تست های استاندارد بیوشیمیایی به عنوان کلبسیلا پنومونیه تایید شدند و سنجش حساسیت آنتی بیوتیکی آن ها با استفاده از روش استاندارد انتشار از دیسک انجام شد. سپس جداسازی باکتریوفاژهای لیتیک علیه ۱۶ جدایه باکتریایی مقاوم به آنتی بیوتیک صورت گرفت. به طور خلاصه نمونه های آب اخذ شده جهت جداسازی فاژ از فاضلاب سانتریفیوژ گردید. مایع رویی با فیلتر ۴۵/۰ میکرومتر فیلتر شد و با محیط کشت تریپتون سوی براث تازه و سولفات منیزیم مخلوط شد و در دمای اتاق انکوبه گردید. سپس محلول موردنظر با کلروفورم مخلوط شده و ارزیابی تولید پلاک با استفاده از روش آگار دو لایه انجام شد. ژنوم باکتریوفاژ با استفاده از آنزیم های HindIII و EcoRV تحت روند آنالیز مولکولی قرار گرفت. تعیین طیف میزبانی فاژهای جداسازی شده با استفاده از روش نقطه ای و آگار دو لایه انجام گرفت. سه باکتریوفاژ دارای طیف میزبانی وسیع تر برای بررسی بیش تر خصوصیات آن ها انتخاب شدند. منحنی رشد یک مرحله ای فاژها ترسیم گردید و زمان نهفته و سایز انفجاری آن ها مشخص شد سپس پایداری و زنده مانی باکتریوفاژهای لیتیک در برابر دماهای مختلف (۲۰، ۳۷-، ۵۰ درجه سلسیوس)، محدوده های مختلف pH (۳، ۴، ۵، ۷، ۹، ۱۱و۱۲) و هم چنین تشعشع UV بررسی گردید. در نهایت خصوصیات شکلی باکتریوفاژ دارای بیش ترین طیف میزبانی (PKpMa۲/۲۰) با استفاده از میکروسکوپ الکترونی مشخص شد. یافته ها: ۳۶ جدایه بالینی باکتریایی براساس تست های استاندارد بیوشیمیایی به عنوان کلبسیلا پنومونیه تایید تشخیص شدند. در آزمایش سنجش حساسیت آنتی بیوتیکی باکتری ها به ترتیب بیش ترین و کم ترین مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به سفازولین (۸۰ درصد) و توبرامایسین (۲۶ درصد) مشاهده گردید. سپس جداسازی باکتریوفاژها علیه همه ۱۶ جدایه منتخب با موفقیت انجام شد. بعد از استخراج ژنوم فاژهای جدا شده تنوع توالی بالایی مشخص گردید. در مورد تعیین طیف میزبانی، PKpMa۲/۲۰ دارای اثر کشندگی روی ۱۱ جدایه از ۱۶ جدایه مذکور بود. در مطالعه منحنی رشد یک مرحله ای سه فاژ دارای طیف میزبانی بیش تر، زمان نهفته سه فاژ جداشده به ترتیب ۱۰، ۱۰ و ۱۵ دقیقه و سایز انفجاری آن ها به ترتیب ۳۵۰، ۲۱۰ و ۱۸۰ برای PKpMa۲/۲۰، P۸ و P۱۰ ارزیابی گردید. هر سه فاژ پایداری خوبی در دمای بین ۲۰- و ۳۷ درجه سلسیوس نشان دادند. در دمای ۵۰ درجه سلسیوس اثر لیتیک فاژ PKpMa۲/۲۰ بیش تر از دو فاژ دیگر بود. فاژ PKpMa۲/۲۰ در بازه pH بین ۳ تا ۱۲ فعال بود در حالی که دو فاژ دیگر در میزان pH برابر با ۳ کاملا از بین رفتند. در بررسی میکروسکوپ الکترونی، باکتریوفاژ PKpMa۲/۲۰ یک دم کوتاه با طول ۱۰ نانومتر و یک سر با قطر ۶۰ نانومتر داشت که احتمالا متعلق به خانواده پودوویریده بود. استنتاج: با توجه به اثرات لیتیک مناسب و نیز زمان نهفته و سایز انفجاری خوب سه فاژ منتخب جدا شده در این مطالعه به خصوص (PKpMa۲/۲۰) و هم چنین پایداری مناسب آن ها در برابر دماهای مختلف و محدوده pH مختلف و نیز تشعشع UV، این فاژها می توانند به عنوان کاندیدا جهت استفاده در فاژ درمانی برای کنترل سویه های مقاوم کلبسیلا پنومونیه عفونی مورد توجه قرار گیرند، اما جهت استفاده درمانی نیاز به تجزیه و تحلیل مولکولی بیش تری می باشد.

Keywords:

Klebsiella pneumoniae , antibiotic resistance , bacteriophage , phage therapy , کلبسیلا پنومونیه , مقاومت آنتی بیوتیکی , باکتریوفاژ , فاژدرمانی , پودوویریده