مقایسه و بهینه سازی روش های مختلف استخراج RNA کل از بافت گل خرما جهت انجام مطالعات مولکولی

جداسازی RNA از بافت های گیاهان چوبی، به خصوص گل های درخت خرما، به دلیل داشتن غلظت های بالایی از ترکیبات فنولیک، پلی ساکاریدها، الیاف فیبری، پروتئین ها، متابولیت های ثانویه (تانن ها، لیگنین ها و ترکیبات چرب) بسیار مشکل است؛ زیرا در برخی از روش های استخراج RNA، کلاف های تولیدی به دلیل وجود آلاینده های ناشناخته حلالیت کمی دارند و در بعضی موارد کلاف های تولیدی ژلاتینی هستند که نشان دهنده وجود آلودگی های پلی ساکاریدها است و کمپلکس این ترکیبات با RNA می تواند RNA را برای کاربردهایی مانند تکنیک RNA-Seq غیرقابل استفاده کند. بنابراین دستیابی به یک روش استخراج مناسب که بتواند RNAی با کمیت و کیفیت مناسب را تولید کند، از اهمیت بالایی برخوردار است. از این رو در مطالعه حاضر به منظور دستیابی به RNAی با کیفیت جهت انجام مطالعات RNA-Seq، هفت روش استخراج RNA (شامل سه کیت (Column RNA Isolation Kit، Total RNA extraction mini kit و Neasy Mini Kit) و چهار بافر استخراج (ترایزول، فنول-کلروفرم، لیتیم کلراید و RNX-PlusTM)) با یکدیگر مقایسه و روش استخراج اسید نوکلئیک از گل های این گیاه بهینه سازی شد. تغییرات صورت گرفته در جهت بهینه سازی استخراج RNA شامل استفاده از تیمار پیش گرما روی بافر استخراج، کاهش دور سانتریفیوژ حذف آلودگی DNA و حذف DEPC می باشد و به منظور از بین بردن DNA ژنومی و پروتئین ها از DNase و پروتئیناز K استفاده شد و پس از استخراج RNA، کمیت و کیفیت آن با استفاده از اسپکتروفتومتری و ژل الکتروفورز مورد بررسی قرار گرفت. از این رو براساس نتایج این مطالعه مشخص شد که از بین کیت ها و روش های استفاده شده تنها روش لیتیم کلراید بعد از تیمارهای از DNase و پروتئیناز K و تغییرات صورت گرفته در جهت بهینه سازی، از کمیت و کیفیت بالایی از لحاظ غلظت RNA استخراجی (ng/µl ۵/۲۴۷) و وضوح باندهای ۲۸SrRNA و ۱۸SrRNA روی ژل آگارز و همچنین بالا بودن نسبت های جذبی A۲۶۰/A۲۸۰ و A۲۶۰/A۲۳۰ برخوردار بود. بنابراین بر اساس نتایج این مطالعه می توان بیان کرد روش بهینه سازی شده انتخابی بر مشکلات استخراج RNA از بافت های سرشار از ترکیبات پلی فنولیک، پلی ساکاریدی، ترکیبات فیبری، لیگنین ها و اسیدهای چرب چون گل خرما فائق آمده و نمونه RNAهای استخراجی توسط این روش برای انجام مطالعات RNA-Seq، توسط این پژوهشگران جهت توالی یابی ارسال شد.

Keywords:

Spectrophotometry , RNA extraction , Agarose gel electrophoresis , Bark tissue , Molecular methods , اسپکتروفتومتری , استخراج RNA , الکتروفورز ژل آگارز , بافت چوبی , روش های مولکولی