بهینه سازی شرایط کشت درون شیشه ای زالزالک خونین (Crataegus atrosanguinea)

چکیده مبسوط مقدمه و هدف: پژوهش در زمینه حفاظت از ژرم پلاسم گونه های درختی بومی و دارویی جنگل های شمال ایران به ویژه زالزالک خونین با خواص دارویی فراوان، دارای اهمیت است. تکثیر جنسی زالزالک به دلایل پوسته ضخیم و دو نوع خفتگی فیزیکی و فیزیولوژیک به سختی و با آپومیکسی امکان پذیر است و تکثیر غیرجنسی آن از راه ریشه دار کردن قلمه نیز با مشکلات فراوانی مواجه است. زالزالک خونین (Crataegus atrosanguinea) از خانواده Rosaceae یکی از گونه های با ارزش جنگل های شمال و غرب کشور محسوب می شود که به‎ دلیل مثمر بودن و داشتن چوب بسیار محکم و خواص دارویی متعدد دارای اهمیت فراوان است. خواص دارویی زالزالک در درمان فشار خون، تصلب شرائین و احتقان قلب، ضعف عضلات قلب و نارسایی کرونر به اثبات رسیده است. زالزالک حاوی متابولیت های ثانویه فراوان مانند فلاونوئیدها و پروآنتوسیانیدین و گیلکوزیدها است. بهینه سازی شرایط کشت درون شیشه ای زالزالک خونین به عنوان یکی از گونه های طبیعی ایران می تواند راهکار مناسبی برای تکثیر آن باشد. پژوهش حاضر با هدف کنترل آلودگی، کنترل قهوه ای شدن و القای کالوس زالزالک خونین (Crataegus atrosanguinea) در شرایط درون شیشه ای انجام شد. کنترل آلودگی ریزنمونه، بذر و بافت گیاهان از اهمیت بالایی برای موفقیت کشت بافت گیاهان محسوب می شود. از آنجا که پرآوری از ریزنمونه های طبیعی گیاهان برای کشت بافت در اولویت قرار دارد، معمولا این مهم با قهوه ای شدن به ویژه برای گیاهان چوبی که دارای ساقه ضخیم و چوبی هستند با مشکلات فراوانی همراه است. تعیین نوع و غلظت تنظیم کننده رشد به‎عنوان یک عامل متغیر برای رشد گیاهان در شرایط درون شیشه ای ضروری است. بعد از اعمال تنظیم کننده رشد به محیط کشت، گیاه واکنش های مختلفی نشان خواهد داد اما یکی از راه های مناسب برای انتخاب مسیر صحیح باززایی گیاهان، تعیین وزن تر و خشک کالوس است که به‎طور گسترده به عنوان معیاری از رشد کالوس ها مورد اندازه‎گیری قرار می‎گیرد. با استفاده از وزن تر و خشک کالوس می توان منحنی رشد کالوس را به دست آورد. نتایج پژوهش های گذشته حاکی از دامنه وسیع تغییرات نوع و غلظت تنظیم کننده رشد بر کالوس زایی و باززایی گونه های مختلف جنس زالزالک است و متناسب با نوع گونه گیاهی باید نوع و غلظت خاصی از تنظیم کننده های رشد را اعمال کرد. مواد و روش ها: ساقه های جوان و سالم زالزالک‎ خونین از لاریجان آمل، استان مازندران، ایران با مختصات جغرافیایی '۳۸° ۵۸ شمالی و '۱۰° ۵۲ شرقی در ابتدای فصل رویش جمع آوری شد. ساقه های جمع آوری شده بلافاصله به آزمایشگاه کشت بافت گیاهی دانشکده منابع طبیعی در دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ایران منتقل شدند. ضدعفونی ساقه های طبیعی زالزالک به‎دلیل آلودگی سطحی و بافتی فراوان بسیار ضروری است. برای این‎منظور از ساقه ها ریزنمونه هایی به اندازه ۰/۵ تا یک سانتی متری برش داده شدند. تیمارهای کنترل آلودگی شامل HgCl۲، H۲O۲، NaClO و AgNO۳ و همچنین برای کنترل قهوه ای شدن ریزنمونه ها پنج تیمار طراحی شد. تیمارهای کنترل قهوه ای شدن شامل شاهد، آب روان، اسیداسکوربیک، پلی وینیل کلراید و ذغال فعال بود. به طور کلی محیط کشت از موادی شامل نمک های معدنی (عناصر کم مصرف و پر مصرف) به عنوان تامین کننده رشد بیشینه، اسیدهای آمینه و ویتامین ها به‎عنوان نیتروژن، قند به‎عنوان منبع کربن و انرژی، تنظیم کننده های رشد به‎عنوان محرک رشد و ریخت زایی، آگار به‎عنوان جامدکننده محیط کشت و آب که ۹۰ درصد محیط کشت را شامل می شود، تشکیل می گردد. محیط کشت به‎کار رفته در این تحقیق MS بود که اولین بار توسط درایور و کنیاکی در سال ۱۹۸۴ ساخته شد و با در نظر گرفتن روش دوفوسارد۱۹۷۶ تهیه شد. در این پژوهش pH محیط کشت روی ۵/۸ تنظیم گردید. برای القای کالوس، تیمارهای IBA، NAA، ۲,۴-D، BAP، TDZ و Kin در سه سطح غلظت ۰/۱، ۱ و ۶ میلی گرم در لیتر و ترکیب ۶ mgl-۱ NAA+۱ mgl-۱ BAP و ۶ mgl-۱ IBA+۱ mgl-۱ BAP در محیط کشت MS استفاده شد. در این مطالعه ریزنمونه های ساقه به‎صورت افقی روی محیط کشت قرار گرفتند. از بین تیمار های مختلف کالوس زایی برای بررسی القای کالوس، درصد کالوس زایی، درجه کالوس زایی، وزن تر و خشک کالوس و مساحت سطح مقطع کالوس اندازه گیری شد. بهترین تیمار از طریق محاسبه مشخصه های مذکور به دست آمد و برای واکشت از آن تیمار استفاده می شد. به طور تقریبی هر ۲۰ روز و در مجموع پنج الی شش بار واکشت انجام گرفت. بعد از کشت کالوس ها در محیط باززایی، ریزنمونه ها در اتاقک کشت و قفسه های سازگاری تحت تیمار ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی در دمای ۲± ۲۵ درجه سانتی گراد با رطوبت ۷۰ درصد قرار گرفتند. یافته ها: نتایج نشان داد که HgCl۲ (۰/۵ درصد، ۱۶ دقیقه) با میانگین ۱۰۰ درصد سلامت به عنوان مناسب ترین تیمار کنترل آلودگی بود. تیمار شاهد با ۹۸ درصد سلامت به عنوان مناسب ترین تیمار کنترل قهوه ای شدن مشاهده شد. همچنین نتایج نشان داد که نوع، غلظت و اثر متقابل نوع و غلظت تنظیم کننده رشد بر مشخصه های القای کالوس زالزالک خونین اثر معنی داری دارد (P<۰.۰۱). بیشترین وزن تر و خشک کالوس، درصد و درجه کالوس زایی و سطح مقطع کالوس در بین تیمارهای اکسین و سیتوکنین به ترتیب برای تیمارهای ۶ میلی گرم در لیتر NAA و تیمار ۱ میلی گرم در لیتر BAP مشاهده شد. همچنین نتایج نشان داد که بیشترین مقدار مشخصه های القای کالوس مورد مطالعه در محیط کشت حاوی ترکیب اکسین و سیتوکنین (۶ mgl-۱ IBA+۱ mgl-۱ BAP) مشاهده گردید. نتیجه گیری کلی: به طور کلی نتایج نشان داد که در حالت عادی و بدون اعمال هیچ تیماری تا ۹۰ درصد احتمال کنترل قهوه ای شدن ریزنمونه های سرشاخه های طبیعی زالزالک خونین وجود دارد. برای ضدعفونی ریزنمونه ها استفاده از کلرید جیوه نیم‎درصد به مدت ۱۶ دقیقه پیشنهاد می شود. ترکیب تنظیم کننده های رشد در محیط کشت برای القای کالوس زالزاک خونین بسیار مناسب ارزیابی شد. ارائه نتایج این پژوهش می تواند دستورالعمل آزمایشگاهی برای باززایی و پرآوری زالزالک خونین فراهم کند.

Keywords:

Apomixis , Browning , Callus induction , Plan growth regulations (PGRs) , Pollution control , آپومیکسی , القای کالوس , تنظیم کننده های رشد , قهوه ای شدن و کنترل آلودگی