بارکدگذاری DNA و مطالعه بیوسیستماتیک گیاه دارویی پنج انگشت (Vitex agnus-castus L.) در استان گلستان

سابقه و هدف: گیاه پنج انگشت (Vitex agnus-castus) یک گیاه دارویی محبوب متعلق به تیره Lamiaceae، بومی مدیترانه و پراکنده در اروپا، آسیا و شمال آفریقاست. این گیاه جزو پرفروش ترین گیاهان دارویی در جهان است؛ با وجود تحقیقات زیاد، همواره بررسی این گونه باارزش حائز اهمیت است. چندین گونه که در حال حاضر در سرده Vitex شناخته شده اند، مورفولوژی قابل تشخیصی از خود نشان نمی دهند که منجر به سردرگمی در شناسایی آنها می شود. از آنجا که کاربرد داروییV. agnus-castus  با سایر گونه ها متفاوت است، بنابراین، شناسایی مناسب این گونه برای عملکرد دارویی موثر ضروریست. در این مطالعه از رویکردهای کلی در شناسایی این گیاه دارویی ازجمله تکنیک های مورفولوژیکی و میکرومورفولوژی و مولکولی استفاده شد.مواد و روش ها: در این مطالعه، ۱۷ جمعیت از گونه مورد نظر در شهرستان مراوه تپه واقع در ناحیه شرقی استان گلستان بررسی شد. نمونه های گرده به طور مستقیم از رویشگاه طبیعی منطقه مورد نظر جمع آوری گردید. پس از استفاده از روش استولیز، از ۳۰-۴۰ دانه گرده از نماهای قطبی و استوایی با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی ۴۰ و ۱۰۰ و با کمک دوربین دیجیتال عکس برداری انجام شد. برای مطالعه ریخت شناسی دانه، میوه های کاملا رسیده از هریک از جمعیت های مورد مطالعه در فصل میوه دهی جمع آوری شد. از هر جمعیت ۲۰ دانه برای عکس برداری با لوپ و میکروسکوپ الکترونی نگه داری شد. میکروگراف های الکترونی از دانه ها و گرده های مناسب در مرکز متالورژی رازی تهران توسط میکروسکوپ الکترونی SEM تهیه شد. استخراج DNA از سلول های برگ نمونه های هرباریومی با استفاده از کیت گیاهی انجام گردید. از توالی ناحیه nrDNA ITS ژنوم هسته ای و trnL-trnF  کلروپلاستی به عنوان بارکد استفاده گردید. واکنش زنجیره ای پلیمراز در حجم ۲۰ میکرولیتر با آغازگرهای مورد نظر و برنامه دمایی مشخص در دستگاه ترموسایکلر انجام شد. پس از انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز، به منظور حصول اطمینان از تکثیر قطعات، محصول نهایی الکتروفورز شد. تک باندهای قوی برای تعیین توالی به شرکت ژنتیک کدون در تهران ارسال گردید. توالی های کروماتیدی حاصل، با اطلاعات موجود در بانک ژنی سایت NCBI تطبیق داده شدند و میزان شباهت گونه ها بررسی شد.نتایج: دانه های گرده تمام گونه ها از لحاظ اندازه کوچک (۲۸-۱۲ میکرومتر) می باشند. شکل دانه گرده طبق طبقه بندی ارتمن در جمعیت های قازان قایه به شکل Prolate spheroidal  (کروی کشیده) و در جمعیت های قوشه تپه از نوع Subprolate  (نیمه کشیده) هستند. تمام دانه های گرده دارای سه شیار می باشند. تزئینات اگزین از نوع ریزمنفذدار در جمعیت قازان قایه و شبکه ای ریزمنفذدار در جمعیت قوشه تپه هستند. بزرگترین دانه ها مربوط به جمعیت قازان قایه با میانگین طول ۳.۸۴ میلی متر و عرض ۱.۵۲ میلی متر می باشد. از نظر شکل همه بادامی شکل هستند اما تزئینات سطح خارجی دانه در جمعیت قازان قایه حفره دار است؛ ولی در جمعیت های قوشه تپه سطح دانه چروکیده و مخطط است. میزان موفقیت تکثیر در مکان ژنی trnL-trnF در نمونه های گیاهی مورد بررسی ۸۵% محاسبه شد. طول قطعه تکثیر شده در این گونه ۵۱۶ نوکلئوتید بود. توالی آن به بانک ژن به منظور ثبت نهایی ارسال شد. طول قطعه تکثیر شده در این گونه با استفاده از نشانگر ITS ۶۷۵ نوکلئوتید توالی یابی شد و کروماتوگرام های حاصل، با اطلاعات موجود در بانک اطلاعاتی (NCBI) تطبیق داده شدند.نتیجه گیری: امروزه داروهای گیاهی محلی در کشورهای مختلف نقش سازنده ای در درمان بیماری ها دارند. ازاین رو بازاریابی حقیقی و مصرف گیاهان دارویی توجه بیشتری می طلبد. بارکدینگ این هدف را به درستی محقق می کند. به طوری که بارکدگذاری DNA گونه های دارویی که صحیح شناسایی شده اند، می توانند به عنوان یک استاندارد برای مقایسه نمونه های گیاهی موجود در بازار با گیاهان دارویی حقیقی استفاده شوند. بنابراین توالی های به کاررفته این تحقیق برای بارکدگذاری گیاه دارویی پنج انگشت مهم است. این گونه دارویی به درستی شناسایی شده است و می تواند به عنوان استاندارد برای ارزیابی گیاهان موجود در بازار استفاده شود.

Keywords:

بارکد هسته ای ITS , بارکد کلروپلاستی trnL-trnF , دانه , گرده , Vitex