تهیه آنتی بادی چند همسانه ای نوترکیب علیه ویروس لکه برگی کلروتیک سیب و بررسی کارایی آن

یکی از ویروس­های مهم آلوده کننده درختان میوه، ویروس لکه برگی کلروتیک سیب (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV است. تهیه آنتی­بادی و طراحی کیت الایزا و بیوسنسورها یکی از راهبردهای مفید در تشخیص زود هنگام عوامل بیماری‎ زا در نمونه­های با تعداد زیاد است. در همین راستا، تحقیق حاضر با هدف تولید آنتی بادی چندهمسانه­ای نوترکیب و طراحی کیت الایزا جهت ردیابی سریع ویروس لکه برگی کلروتیک سیب با استفاده از بیان در سیستم پروکاریوتی انجام شد. ابتدا، سازه pTG۱۹-ACLSV-CP به باکتریEscherichia coli  سویه DH۵α منتقل و پس از تکثیر و استخراج پلاسمید نوترکیب، ژن پروتئین پوششی با استفاده از آنزیم­های برشی خارج و درون پلاسمید بیان pET۲۸(a) همسانه سازی گردید. سازه بیان pET۲۸-ACLSV-CP ساخته شده به منظور بیان پروتئین، به باکتری E. coli  سویه BL۲۱(DE۳) منتقل شد. پس از بهینه سازی، بیان و استخراج پروتئین پوششی، نوار پروتئینی با اندازه تقریبی ۲۷ کیلودالتون چهار ساعت بعد از القاء مشاهده شد. سپس، پروتئین بیان شده به روش طبیعی با ستون Ni-NTA Agarose، خالص سازی انجام شد. پروتئین خالص شده، به عنوان آنتی ژن به خرگوش ماده نژاد نیوزیلندی طی چهار مرحله تزریق شد. ایمنوگلوبولین­ها با استفاده از کیت تخلیص IgG مبتنی بر پروتئین A از سرم خون به دست آمده از خرگوش­های ایمن شده تخلیص شدند. کارایی ایمنوگلوبولین های خالص شده، نشان داد که کاربرد غلظت ۱:۱۰۰۰ آنتی بادی نوترکیب تهیه شده و نشاندار برای ردیابی آنتی ژن های موردنظر مناسب هستند. نتایج حاکی از تولید آنتی بادی با اختصاصیت مناسب جهت ردیابی ویروس لکه برگی کلروتیک سیب و کارایی آنتی بادی­ها تولید شده برای شناسایی این ویروس برای غربال نهال­ها و باغات است.

Keywords:

ACLSV , Polyclonal antibody , IgG , ELISA. , : لکه برگی کلروتیک سیب , آنتی بادی چند همسانه ای , ایمونوگلوبولین گاما , الایزا.