ارزیابی روش مولکولی LAMP برای تشخیص سریع، حساس و کارآمد آلودگی باکتریایی

پس از ابداع روش مولکولی واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)، استفاده از این روش برای تشخیص آلودگی های میکروبی بشدت گسترش یافت. با گسترش اطلاعات در مورد این روش، روش های توسعه یافته ای، بر مبنای PCR همچون Real-RT PCR ،Multiplex PCR ،Time PCR و ... به وفور مورد استفاده قرار گرفتند. این روش ها نسبت به روش های تشخیصی ای که سابقا مورد استفاده قرار می گرفتند مانند روش های فنوتیپی که بر مبنای کشت عامل آلودگی و بررسی ویژگی های مورفوژیک و بیوشیمایی آن بود، مزایای بسیار مهمی از جمله اختصاصیت و حساسیت بالا در تشخیص را دارا بود. اما به همراه این مزایا، معایبی مانند، وقت گیر بودن، نیاز داشتن به تجهیزات مدرن و گران قیمت و همینطور تکنسینی با مهارت بالا بدلیل پیچیدگی این روش ها را داشتند و این موارد سبب می شد که در مکان هایی با امکانات ناکافی و تجهیزات قدیمی و فاقد افراد متخصص، عملا استفاده از این روش ها ناممکن شود. به همین دلیل نیاز به روشی سریع، آسان، بدون نیاز به مهارت های بالا و تجهیزات به روز همینطور با قدرت شناسایی و حساسیت بالا مخصوصا برای مناطق محروم حس می شد که سرانجام در سال ۲۰۰۰ میلادی، نوتومی و همکاران، روش مولکولی بنام تکثیر هم دمای وابسته به حاقه (LAMP) را ابداع و معرفی کردند که در این روش بدلیل استفاده از آنزیم Bst polymerase و قابلیت جابجایی رشته (Displacement) در این آنزیم، واکنش عملا نیازی به چرخه ی دمایی و دستگاه ترموسایکلر نداشت. در این مطالعه به بررسی روش LAMP و ویژگی های آن پرداخته شده است. مواد و روش تحقیق: باکتری سالمونلا گونه ی انتریکا، زیر گونه ی انتریکا، سرووار تیفی موریوم بعنوان باکتری هدف برای تشخیص و باکتری های اشرشیاکلی، کلبسیلا پنومونیه و آسینوباکتر بومانی بعنوان باکتری های کنترل منفی انتخاب شدند. مطالعات بیوانفورماتیکی روی ژنوم جنس سالمونلا صورت گرفت و براساس نتایج بدست آمده از BLAST، ژن invA (کد کننده ی پروتئینی به همین نام (InvA) هست و در نفوذ سالمونلا به میزبان نقش داشته و جزئی از سیستم ترشحی نوع III در سالمونلا است) بعنوان یک ژن شاخص در تمامی اعضای جنس سالمونلا انتخاب و برای آن ۴ جفت پرایمر طراحی گردید. سپس استخراج DNA با روش استاندارد Boiling و Freeze-Defreeze بصورت همزمان انجام شد. برای تعیین حساسیت واکنش، از DNA مستخرج از سالمونلا یک سریال رقت تهیه گردید. در مرحله ی بعد، نمونه های DNA به همراه مواد مورد نیاز برای واکنش (مسترومیکس واکنش ) در یک حمام آب گرم، در دمای ثابت ۶۵c به مدت ۶۰ دقیقه تحت آزمون با روش LAMP قرار گرفتند. در آخر برای مشاهده ی نتایج از رنگ NA Safe Stain (که در صورت اتصال به DNA ۲ رشته ای، ساطع کردن نور فلئورسنت فسفری کرده که در طول موج مشخصی قادر به مشاهده می باشد و در غیر این صورت بدون تغییر رنگ (رنگ نارنجی اولیه) باقی می ماند) و برای تایید نتایج از روش ژل الکتروفورز و دستگاه ژل داک استفاده شد. دستاوردها: بعد از اتمام واکنش، نمونه هایی که در آن ها تکثیر اتفاق افتادته بود (نمونه های سالمونلایی)، کدر شده و دیگر نمونه ها شفاف باقی مانده بودند که این روش مشاهده ی نتایج در بین تمامی روش های تشخیصی منحصر به فرد بود.بود. سپس مقداری از نمونه های برای تایید با روش ژل الکتروفورز برداشته شد و به مابقی رنگ مذکور اضافه گردید که تمامی نمونه های DNA سالمونلایی در طول موج ۴۷۰nm زیر دستگاه ترلنس ایلومیناتور به رنگ سبز فسفری (فلئورسنت) دیده شدند و الباقی نمونه ها قادر به ساطع کردن رنگ فلئورسنت نبوده و نارنجی رنگ باقی مانده بودند که نتیجه ی مذکور در بالا را تایید کرد. در روش ژل الکتروفورز (آگارز ۲%، بافر TBE و رنگ SYBR Safe) برای تایید ۲ روش مشاهده ی نتایج مذکور (کدورت و اضافه کردن رنگ)، فقط نمونه های سالمونلایی باند ایجاد کرده بودند و دیگر نمونه قادر به ایجاد باند نبودند (تکثیر نشده بودند). نتیجه گیری : واکنش LAMP موفق شد در یک حمام آب گرم (Hot Plate)، در دمای ثابت ۶۵c و در زمان ۱ ساعت، تا مقدار ۳.۲۱ng/μl از DNA سالمونلایی را تکثیر کرده و طبق انتظار از تکثیر DNA دیگر باکتری ها باز بماند . این مطالعه نشان داد LAMP می تواند بعنوان یک روش ساده و کارآمد، آلودگی سالمونلایی را بدون نیاز به تجهیزات آزمایشگاهی مدرن و گران قیمت و افراد متخصص در مدت زمان حدودا ۱ ساعت، با اختصاصیت و حساسیت بسیار بالا، ایضا با متد مشاهده ی نتایج ساده و ارزان در مقایسه با دیگر روش ها، تشخیص دهد.

Keywords:

باکتری , سالمونلا , تشخیص , مولکولی , , تکثیر هم دما وابسته به حلقه