اثرات نانوذرات کورکومین و قند ساکارز بر پارامترهای کیفی و ساختاری اسپرم اپیدیدمی قوچ نژاد شال پس از سردسازی

چکیده مبسوط مقدمه و هدف: تلقیح مصنوعی یکی از ابزارهای مدیریتی مهم برای کنترل فعالیت­ های تولیدمثلی و افزایش بازده صنعت پرورش دام می باشد. این تکنیک می ­تواند نقش مهمی در پیشرفت ژنتیکی حتی در گله های کوچک می شود. آماده سازی اسپرم جهت اجرای تکنیک های تولیدمثلی مانند تلقیح مصنوعی از اهمیت ویژه ای برخوردار است. اما در طول آماده سازی و نگهداری اسپرم، عوامل متعدد آسیب زا مانند شوک دمایی و تنش اکسیداتیو موجب کاهش کیفیت اسپرم ها شده و به طور مستقیم باروری اسپرم را تحت تاثیر قرار می دهند. لذا افزودن مواد محافظت کننده و آنتی اکسیدان در رقیق کننده امری ضروری در حفظ کیفیت اسپرم در مراحل سردسازی و انجماد محسوب می شود.کورکومین ماده زرد رنگی است که از ریشه زردچوبه حاصل می شود واز نظر ساختار بیوشیمیایی با داشتن حلقه فنلی و بخش بتا دی- کتونی در ساختمان خود می تواند رادیکال های آزاد را خنثی کند ولی در محیط های آبدوست حلالیت پایینی دارد. جهت رفع این مشکل، روش نانولیپوزوم پیشنهاد شده است که با بهره گیری از این روش، علاوه بر رفع مشکل حلالیت پایین کورکومین در محلول های آبی، نانو ذرات کورکومین بصورت کاملا هدفمند به داخل سلول هدف هدایت و تاثیرات خود را انجام می دهد. از طرف دیگر قند ساکارز با آبکشی اولیه سلول های اسپرم و حفظ فشار اسمزی محیط رقیق کننده، اسپرم ها را از شوک سرمایی محافظت می کند. هدف از انجام این مطالعه، بررسی اثرات استفاده جداگانه و مخلوط سطوح مختلف نانو ذرات کورکومین و قند ساکارز در رقیق کننده اسپرم اپیدیدمی قوچ طی نگهداری در دمای C˚۵  در زمان های مختلف سردسازی بود. مواد و روش ها: مطالعه حاضر در آزمایشگاه فیزیولوژی دام گروه علوم دام و طیور پردیس کشاورزی ابوریحان دانشگاه تهران انجام شد. بافت های بیضه در روز آزمایش از کشتارگاه تهیه و به وسیله فلاکس مخصوص در فاصله کمتر از یک ساعت به آزمایشگاه منتقل شدند. اسپرم از ناحیه دم اپیدیدیم بافت بیضه قوچ در آزمایشگاه جمع آوری شد. نمونه های اسپرم پس از ارزیابی اولیه و دارا بودن تحرک پیشرونده ببیش از ۷۵ درصد و ناهنجاری کمتر از ۱۰ درصد انتخاب و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به رقیق کننده افزوده شدند. ترکیب رقیق کننده در این مطالعه شامل: تریس ۲۷/۱ گرم در لیتر، اسید سیتریک ۱۴ گرم در لیتر، فروکتوز ۱۰ گرم در لیتر، زرده تخم مرغ ۲۰ درصد، گلیسرول ۷ درصدبود که PH رقیق کننده در حدود ۶/۸ – ۷/۲ و اسمولاریته در حدود ۳۱۰- ۳۲۰ میلی اسمول تنظیم گردید. قند ساکارز ساخت شرکت سیگما آلدریج تهیه شد و نانوذرات کورکومین نیز از پودر کورکومین خالص ساخت شرکت سیگما آلدریج به روش نانولیپوزوم و با استفاده از دستگاه های روتاری، هموژنایزر و سونیکاتور پروپ تهیه شد. برای بررسی اندازه ذرات نانوذرات کورکومین نیز از دستگاه DLS استفاده شد و ذرات در حدود کمتر از ۸۰ نانوگرم بودند. گروه های آزمایشی شامل غلظت های ۲۵ و ۵۰ میکرومولار نانوذرات کورکومین (NC)، ساکارز (S) در دو غلظت ۱۰۰ و ۱۵۰ میلی مولار بصورت جداگانه، سطوح ترکیبی شامل (۲۵NC۱۰۰S، ۲۵NC۱۵۰S، ۵۰NC۱۰۰S، ۵۰NC۱۵۰S) و یک گروه فاقد این افزودنی ها (شاهد) بودند که در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به رقیق کننده اضافه شدند. رقیق کننده های حاوی سطوح مختلف تیماری در فالکون های ۱۵ میلی لیتر و در داخل ظرف آب هم دما به داخل یخچال منتقل شدند که به صورت تدریجی در طول حدود ۲ ساعت به دمای C˚۵ رسیدند. پس از تثبیت در این دما، در زمان های ۶، ۱۲، ۲۴ و ۴۸ ساعت، پارامترهای جنبایی کل، جنبایی پیش رونده با استفاده از سیستم کاسا، زنده مانی با روش ائوزین- نیگروزین (۱۶/۷ گرم ائوزین، ۱۰۰ گرم نیگروزین، ۲۹ گرم بافر سیترات در یک لیتر آب دوبار تقطیر)، یکپارچگی غشایی  با روش محلول HOST (۹ گرم فروکتوز، ۴/۹ گرم سیترات سدیم در یک لیتر آب دو بار تقطیر با اسمولاریته ۱۰۰ میلی اسمول) و درصد ناهنجاری های اسپرم با استفاده از محلول هانکوک (۶۲/۵ لیتر فرمالین ۳۷ درصد، ۱۵۰ میلی لیتر محلول سالین، ۱۵۰ میلی لیتر محلول بافر و ۵۰۰ میلی لیتر آب دو بار تقطیر) ارزیابی شدند. نتایج حاصل از آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی به وسیله نرم افزار SAS (۹/۲) و رویه GLM آنالیز و سطح معنی داری (۰/۰۵P<) در نظر گرفته شد. برای مقایسه میانگین تیمارها نیز از آزمون توکی استفاده شد. یافته ها: نتایج این مطالعه نشان داد که استفاده از۲۵NC۱۰۰S  در رقیق کننده موجب بهبود پارامترهای جنبایی کل، جنبایی پیش رونده، زنده مانی و یکپارچگی غشای اسپرم اپیدیدیمی قوچ در تمامی زمان های مورد ارزیابی نسبت به سایر گروه ها بخصوص گروه شاهد شد (۰/۰۵p<). در مورد درصد ناهنجاری های اسپرم در زمان های ۶ و ۱۲ ساعت بین تیمارها تفاوت معنی داری مشاهده نشد (۰/۰۵p>) ولی در زمان های ۲۴ و ۴۸ ساعت غلظت۲۵NC۱۰۰S  موجب کاهش معنی دار درصد ناهنجاری های اسپرم نسبت به سایر غلظت ها شد (۰/۰۵P<). افزودن سطوح مختلف نانوذرات کورکومین و قند ساکارز بصورت جداگانه نسبت به گروه شاهد به‎ طور معنی داری پارامترهای مورد ارزیابی را بهبود داده بودند ولی بهترین عملکرد در تیمار ترکیبی مشاهده شد که می‎ تواند نشان دهنده نقش هم ‎افزایی این دو ترکیب باشد. نتیجه گیری: نتایج مطالعه حاضر نشان داد که استفاده از مخلوط نانوذرات کورکومین با ساکارز در رقیق کننده می تواند اسپرم ها را در برابر آسیب های اکسیداتیو و شوک سرمایی محافظت کند. اثرات آنتی اکسیدانی نانوذرات کورکومین و اثرات محافظتی قند ساکارز می تواند علت تاثیر مثبت بر کیفیت اسپرم اپیدیدیمی قوچ در زمان های سردسازی باشد و از این رو استفاده از سطح ۲۵NC۱۰۰S در رقیق کننده اسپرم قوچ توصیه می شود.

Keywords:

Sperm quality , Oxidative Stress , Cold Shock , Curcumin , Nanoliposome , کیفیت اسپرم , تنش اکسیداتیو , شوک سرمایی , کورکومین , نانولیپوزوم