افزایش توکسین زایی و کاهش زمان رشد با تغییر فرمولاسیون محیط کشت و شرایط کشت

باکتری کلستریدیوم نویی بعنوان یک باکتری بیماری زا با تولید توکسین های و آنزیم های مختلف می باشد. این باکتری قادر است با تولید توکسین آلفا بعنوان یکی از موثرترین عامل این باکتری در ایجاد بیماری قانقاریا، باعث تخریب سلولی و مرگ حیوان شود. این باکتری بی هوازی بوده و دوره رشد آن نسبت به سویه های دیگر کلستریدوم پرفرژنس بیشتر است که این خود باعث تولید توکسین در زمان طولانی و غیر فعال شدن آن در طولانی شدن کشت می شود. روش کار: در این طرح سعی شده است با تغییرات کمی در محیط کشت و استفاده از مقادیر مناسب و همچنین جابجایی مواد و همچنین استفاده از روش تولید ، بیشترین کارآیی را از رشد باکتری در تولید واکسن ایجاد نمود. در این تحقیق ابتدا باکتری با روش های کنترلی ارزیابی و تایید شده و سپس شرایط تولید و فرمولاسیون محیط کشت بررسی گردید. در این بررسی ابتدا غلظت های مختلف منابع کربنی با مالتوز و گلیسرول در محیط کشت و اثر آن بر رشد و تولید توکسین ارزیابی شد. در طول بررسی فعالیت رشد و تولید توکسین معیار اندازه گیری توکسین بر اساس گرد شدن سلول های vero و در ادامه اندازه گیری با استفاده از الیزا می باشد. تغییر منبع پروتینی مورد استفاده بعنوان تامین کننده آمینو اسید های و نیتروژن محیط کشت با حذف پودر جگر و تغییر درصد های پپتون و عصاره مخمر انجام شد. کشت بصورت یکنواخت از کشت اولیه 24 ساعته به میزان 1 % تلقیح و در شرایط بی هوازی رشد داده شد. پس از 48 ساعت رشد ، میزان توکسین آلفا با استفاده از روش اثر بر روی سلول های vero و میزان گرد شدن ارزیابی گردید. در ادامه اثر ترکیب ویتامین و مینرال در غلظت ها مختلف بر رشد و تولید توکسین ارزیابی گردید. ارزیابی نهایی فرمول محیط کشت برای تولید و کشت سریع باکتری در بن بن و فرمانتور بصورت مقایسه ای در شرایط تقریبا یکسان انجام و میزان توکسین و رشد بررسی گردید. آزمون های های کنترلی شامل SDS – PAGE ، الیزا و کشت سلول برای بررسی عملکرد روش های تولید استفاده گردد. نتایج:کشت فعال تهیه شده ار آمپول واکسن در محیط کشت آگار خونی و محیط کشت های مورد بررسی و تایید گردید در ادامه نتایج خصوصیات باکتری کلستریدیوم نویی با آزمون های انجام شده مورد تایید نهایی قرار گرفت و سوش واکسن برای آزمون های تولید و کنترل واکسن مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت همولیزین بعنوان یک آنزیم فعال در ترشحات باکتری به صورت کمی و کیفی تعیین و در ادامه آلفا توکسین نیز با آزمون های کشت سلولی بر روی سلول های Vero نشان داد که، گردشدن سلول ها در اثر فعالیت توکسین کاملا قابل مشاهده و اندازه گیری می باشد. میزان فعالیت آلفا توکسین بر اساس استاندارد تعیین شده برای کشت دوم برابر 52000 Cytotoxicity activity (CU/ml) محاسبه گردید. نتایج نشان داد که توکسین تولید شده دارای فعالیت مناسب بوده و باکتری مورد استفاده از تولید مناسبی برای تهیه آنتی ژن برخوردار می باشد. بررسی اثر کربن بر رشد و فعالیت توکسین نشان داد که نیم درصد مالتوز همراه با 2 درصد گلیسرول دارای بهترین شرایط تولید توکسین و رشد می باشد. همچنین بررسی منبع پروتیین و مکمل مصرفی مشخص کرد که حذف عصاره جگر در فرآیند رشد بدلایل حضور ممانعت کننده ها می تواند رشد باکتری و تولید توکسین را بهبود ببخشد. استفاده از ویتامین ها بعنوان عوامل محرک رشد و همچنین مینرال ها نشان داد که، استفاده مناسب از این ترکیبات می تواند در میزان رشد و تولید توکسین افزایش مناسبی ایجاد نماید. مقایسه شرایط تولید در کشت بن بن با دو روش فرمولاسیون محیط کشت قدیم و جدید نشان داد که محیط کشت فرمولاسیون جدید دارای سرعت رشد بیشتری و تولید توکسین بیشتری نسبت به محیط کشت فرمولاسیون قدیمی می باشد. بشکلی که زمان رشد به حدود یک سوم کاهش یافته و میزان توکسین به میزان قابل توجهی افزایش یافته است. ارزیابی حضور توکسین با روش های کنترلی SDS-PAGE و الیزا نشان از حضور میزان توکسین حدود 3 برابری در کشت های محیط جدید دارد. بر اساس نتایج فوق میزان فعالیت توکسین بر روی سلول های vero برای محیط جدید 1800 TU/ml و برای محیط قدیمی 260 TU/ml تعیین گردید. این ارزیابی در روش MLD نیز کاملا قابل مشاهد می باشد.نتایج بررسی نشان داد که کشت در فرمانتور به میزان 40-50 درصد در مقدار توکسین تولید شده موثر بوده و از طرفی فرآیند تولید بسیار آسان تر و در حجم بیشتری انجام میگردد. لذا در فرایند های تولید روش فرمانتور جایگزین روش بن بن می گردد.این مزیت می تواند علاوه بر کاهش هزینه های تولید بر سرعت تولید نیز موثر باشد. برای اصلاح روش های تولید واکسن علاوه بر ساختار محیط کشت بایستی بر نوع تولید و فرآیند آن نیز توجه شود.