تعیین سروتیپهای هموفیلوس آنفلونزا جدا شده از نمونه های کلینیکی

هموفیلوس آنفلونزا Haemophilus influenzae (Hi) یک باکتری گرم منفی، منحصرا پاتوژن انسانی است که عامل عفونت های گوناگونی هم چون مننژیت، اپی گلوتیت، پنومونی، سلولیت، باکتریمی، آرتریت عفونی و عفونت ملتحمه چشم است. در کشورهای همسایه ایران مثل کویت و عربستان نزدیک به نیمی از مننژیت های باکتریال کودکان بوسیله هموفیلوس آنفلونزا ایجاد می شوند. شیوع مننژیت باکتریایی بیشتر در فصل زمستان میباشد. ویرولانس این باکتری وابسته به حضور و یا عدم حضور کپسول و همچنین نوع آن می باشد. شش سروتیپ اصلی از هموفیلوس آنفلونزا شناسایی شده اند که از a تا f نام گرفته اند. تقسیم بندی آنها بر اساس تفاوت آنتی ژنی در کپسولهای پلی ساکاریدی آنها صورت می گیرد. روشهای معمول برای تشخیص این باکتری شامل کشتهای باکتریولوژیک و کشتهای سلولی, روشهای بیوشیمیایی و شمارش سلول در مایع مغزی نخاعی از حساسیت بالایی بر خوردار نیست. بنابر این یافتن یک روش سریع و دقیق جهت تشخیص انواع کپسوله و غیرکپسوله این باکتری شامل روش های مانند سروتایپینگ استاندارد با آنتی سرم های اختصاصی (SAST) و یا با PCR , از ضرورتهای امروز است. هدف اصلی این تحقیق، تشخیص سروتیپ های هموفیلوس انفلوانزا جداشده از نمونه های بالینی و مقایسه روشهای کشتی با روش PCR است. 73 نمونه سرم خون و مایع نخاعی کودکان مبتلا به مننژیت و علایم مشابه به سینه پهلو، 4 نمونه مخاط چشم از بیماران مبتلا به ورم ملتحمه و 44 نمونه از ترشحات گلو از افراد سالم جمع آوری و جهت تعیین حضور سروتیپ های هموفیلوس انفلوانزا مورد استفاده قرار گرفت. نمونه های جمع آوری شده مستقیما در محیط های اختصاصی کشت و در دمای 37 درجه سانتی گراد و در حضور 5 درصد CO2 کشت داده شد. تشخیص اولیه شامل رشد در حضور فاکتورهای XV و پدیده ساتلیتیسم بود که 38 نمونه هموفیلوس انفلوانزا با این روش جدا و شناسایی شدند. با استفاده از آنتی سرم پلی والنت هموفیلوس انفلوانزا تمامی نمونه های جدا شده تایید و سپس سروتیپ های موجود توسط آزمایش SAST با استفاده از آنتی سرم های اختصاصی (a تا f) شناسایی شدند. نتایج این روش نشانگر13 نمونه تیپ ب, 2 نمونه از تیپ e, 4 نمونه تیپ f بود. ما بقی19 نمونه که با روش کشت هموفیلوس انفلوانزا تشخیص داده شده بودند و با آنتی سرم های اختصاصی هیچ واکنش نشان ندادند را بعنوانNTHi شناسایی نمود. از آنجایی که روشهای کشت و SAST در تشخیص افتراقی بین سروتیپ های این باکتری قوی نمیباشد, در این مطالعه از روش PCR استفاده و نتایج هر دو روشها نیز در تشخیص افتراقی سروتیپ های هموفیلوس انفلوانزا جدا شده, مقایسه گردید. از تمام ایزوله های جدا شده و نمونه های سرم و مایع نخاع DNAاستخراج و با پرایمرهای ژن A bex مورد آزمایش قرار گرفت. توسط این پرایمر 27 نمونه کپسولار و ما بقی 17 نمونه بعنوان غیرکپسولار جدا شدند. سپس جهت مشخص نمودن نوع کپسول a تاf پرایمرهای اختصاصی هر شش نوع استفاده شد. توسط این روش اختصاصیPCR، 23 نوع b، دو نوع f، دو موتانت تیپb فاقدکپسول (Hib-) تفکیک و مابقی آنها بدون کپسول17) (NTHi تلقی شدند. با روش SAST دو نوع تیپ e بعنوان نوع f و-Hib فاقد کپسول و 3 نوع تیپ f بعنوان NTHi با PCR شناسایی شدند. همچنین, شش نمونه کشت منفی با روش PCR حضور هموفیلوس انفلوانزا تیپ ب را نشان دادند. اختلافات بین روشهای SAST و PCR در سروتایپنگ هموفیلوس انفلوانزا جدا شده 41 درصد بود. میزان حساسیت (sensitivity)، اختصاصی (specificity) و ضریب دقت (test efficiency) روش PCR به ترتیب 73/94، 100و 98 درصد می باشد. بدلیل ارتباط اختصاصی بیوتایپ ها با عفونت های متفاوت, منابع, ویژگیهای آنتی ژنیک و مقاومت آنتی بیوتیکی, در این مطالعه بیوتایپ های سویه های هموفیلوس انفلوانزا جداشده نیز مورد برسی قرار گرفت. این باکتری به هشت بیوتایپ بر اساس سه تست ایندول، اورآز و دکربوکسیلاسیون اسیدآمینه اورنیتین تقسیم می شود. این بررسی همینطور که قبلا اشاره شده ، به دلیل ارتباط بیوتایپ ها با عفونتی خاص و هم چنین الگوی مقاومت ضدمیکروبی انجام گرفت که با تعیین میزان شیوع و بیوتایپ هموفیلوس انفلوانزه ارتباط آن با نوع عفونت ایجاد شده نیز بررسی می گردد. در این برسی بیشترین بیوتایپ به ترتیب بیوتایپ IV,III,I,II V, و VIII بود. سایر بایوتایپ ها شامل VIو VIIدر این مطالعه یافت نشدند. بیشترین مقدار بایوتایپ II متعلق به تیپ b هموفیلوس انفلوانزا که از افراد مشکوک به مننژیت بود تعلق داشت. همچنین بایوتایپ هایIV, V, VIII فقط در نمونه های فاقد کپسول NTHi که مخصوصا از نمونه های افراد سالم جدا گردیده بود دیده شد.مقاومت دارویی این باکتری به ترتیب کوتریمیوکسازول (57.14درصد) آمپی سیلین (53.67درصد) تتراسایکلین (38.28درصد) آموکسلین (34.70درصد) فلومکویین (31.54درصد) کلرامفینکل (12.87درصد) و به دنبال آن سفوترکسیم (11.2 درصد) بوده. تمامی نمونه های آزمایش شده به سفوروکسیم حساس بوده و فاقد هیچ نوع مقاومت بودند.نتیجه گیری: نتایج این مطالعه حاکی از آن است که روش PCR دقیق تر از روش SAST که به عنوان روش استاندارد طلایی سروتیپ در نظر گرفته می شود، جهت شناسایی دقیق سروتیپ های هموفیلوس انفلوانزا می باشد. از آنجایی که آنتی سرم برپایه آزمون دلمه شدن با اشکالات تفسیری مواجه می شود بنابر روش PCR ژنومی یک پیشنهاد متناوب معقول تری برای تعیین سروتیپ ها را فراهم می آورد. به علاوه، موتانت های سروتیپ b را فقط با روش PCR میتوان تشخیص داد. در انتها سروتیپ های f و NTHi حاضر در جمعیت ما نیازمند مطالعات بیشتری را دارد.کلیدواژه: هموفیلوس انفلوانزا، مننژیت، سروتایپ، بایوتایپ، ژن bexA، مقاومت دارویی، PCR،SAST