گزارش نهایی طرح تحقیقاتی بررسی تهیه پروتکل تکثیر و باززایی، و انتقال ژن در گیاه گوجه فرنگی

میزبانهای مختلفی برای تولید پروتیینصهای نوترکیب مورد استفاده قرار گرفتهصاند که از آن جمله میصتوان به گیاهان برگی (مانند کاهو)، غلات و لگومها، دانهصهای روغنی، میوهصها، سبزیجات، کشت سلولی و بافت گیاهان عالی، سیستمصهای هیدروپونیک، جلبکصها و ... اشاره نمود. هر کدام از این سیستمصها دارای مزایا و معایبی هستند. با توجه به بسیاری از جنبه های اقتصادی، ایمنی، راحتی مصرف و تولید و ... بر مبنای تجارب موجود، گیاه گوجه فرنگی انتخاب شد. این گیاه بیومس بالایی داشته، امکان کشت گلخانه ای آن فراهم بوده و قابلیت مصرف به صورت خام را هم دارد. از آنجا که مبنا و پایه انتقال ژن به گیاهان کشت بافت گیاهی می باشد، وجود یک روش عمومی، سریع و مناسب برای کشت بافت و باززایی گیاهان می تواند به تسریع و تسهیل برنامه های مهندسی ژنتیک آن کمک بسزایی نماید. از طرف دیگر، کشت بافت می تواند بعنوان روشی مهم و اقتصادی در تکثیر رویشی گیاهان تلقی گردد؛ به نحوی که می توان گیاهان دگرگشن را بدون تغییر در ریخت توارثی شان در سطح اقتصادی تکثیر و تولید نمود. از سوی دیگر، اقتصادی بودن هر برنامه تکثیر انبوه نیز مستلزم وجود یک روش کلی و بهینه اقتصادی می باشد. در این بررسی، از دو رقم از ارقام استاندارد گیاه گوجه فرنگی ‭(Red Cherry ‬و ‭Early Urbana VF) ‬در شرایط آزمایشگاهی جهت بهینه سازی کشت بافت این گیاه استفاده گردید. بدین منظور پس از سترون نمون و کشت بذور این ارقام در محیط جوانه زنی، از گیاهچه های حاصله سه نوع ریزنمونه (لپه، محور زیر لپه و برگ) تهیه و در محیطهای باززایی حاوی انواع و غلظت های مختلفی از تنظیم کننده رشد سایتوکنین ‭(BAP‬، ‭Zeatin ‬و ‭TDZ ‬هر کدام در دو سطح ‮‭0/5‬ و 1 میلی گرم بر لیتر) کشت شدند. سپس اطلاعات مربوط به باززایی این ریزنمونه ها، در یک آزمایش فاکتوریل با سه فاکتور رقم، ریزنمونه و هورمون، در قالب طرح کاملا تصادفی و با سه تکرار مورد مقایسه و تجزیه آماری قرار گرفت. در پایان روشی بهینه جهت کشت بافت و باززایی این گیاه با توجه به نقش هر عامل ارایه گردید. در ادامه، با توجه به روش بهینه شده کشت بافت، روشی مناسب جهت انتقال ژن به این گیاه به واسطه اگروباکتریوم و با استفاده از ژن گزارشگر ‭gus ‬ارایه گردید. بدین منظور، ژن ‭gus ‬در دو ناقل دوتایی ‭pBI‬‮‭121‬ و ‭pCAMBIA‬‮‭3301‬ بصورت مجزا به دو رقم مورد آزمایش وارد شده و نمونه ها در محیطهای باززایی بهینه شده قرار گرفتند. پس از محاسبه درصد تراریختی تیمارها، میزان تاثیر ناقل ها، ارقام و ریزنمونه ها در کارایی انتقال ژن به این گیاه مشخص گردیده و روشی مناسب و کارا جهت دستورزی ژنتیکی این گیاه پرمصرف از طریق مهندسی ژنتیک ارایه گردید. نتایج نشان داد که رقم ‭Red Cherry ‬از پتانسیل خوبی برای تولید گیاه جدید در شرایط آزمایشگاهی برخوردار می باشد. همچنین هورمون ‭BAP ‬با غلظت 1 میلی گرم بر لیتر و ‭Zeatin‬با غلظت ‮‭0/5‬ میلی گرم بر لیتر و ریزنمونه برگ به عنوان بهترین هورمون ها و ریزنمونه برای باززایی این گیاه معرفی شدند. با توجه به نتایج بدست آمده از آزمون هیستوشیمیایی و واکنش زنجیره ای پلیمراز، میزان تراریختی در رقم ‮‭7/1‬ ‭Red Cherry ‬درصد و در رقم ‮‭8/0‬ ‭Early Urbana VF ‬درصد بود. در نتیجه رقم ‭Red Cherry ‬از پتانسیل مطلوب تری برای انتقال ژن در این بررسی برخوردار بود. با توجه به نتایج حاصل، پلاسمید ‭pCAMBIA‬‮‭3301‬ که حاوی ژن مقاومت به علفکش فسفینوتریسین (ژن ‭bar) ‬می باشد، برای انتقال ژن به گیاه گوجه فرنگی مناسب تر می باشد و بهتر است سازه های ژنی طراحی شده برای آزمایشصهای انتقال ژن به داخل این پلاسمید وارد گردد. همچنین هر دو هورمون مورد استفاده که بعنوان هورمون های مناسب در باززایی، از عملکرد نسبتا مشابه و مطلوبی در انتقال ژن به گیاه گوجه فرنگی برخوردار بودند. تنها نکته در مورد اختلاف دو هورمون در تفاوت شکل گیاهان ایجاد شده توسط آن ها بود. هورمون زآتین ریبوزاید گیاهانی با اندام هوایی بلند و کشیده و همراه با ریشه های افشان و بلند ایجاد نمود که شباهت بیشتری به گیاه طبیعی داشتند. هورمون ‭BAP ‬ایجاد گیاهانی با تعداد زیادی شاخساره ولی کوتاه قد نمود و ریشه های این گیاهان نیز ضخیم تر و کوتاه تر بودند. در پایان رقم ‭Red Cherry‬، پلاسمید ‭pCAMBIA‬‮‭3301‬ و ریزنمونه محور زیر لپه بیشترین درصد تراریختی را از خود نشان دادند. کلمات کلیدی: گوجه فرنگی، باززایی، تراریختی، اگروباکتریوم، ‭gus