بررسی در مورد تهیه رده سلولی حاوی شیزونت تیلریا آنولاتا بروش عفونت آزمایشگاهی سلول های منوسیت ماکروفاژی با فرم اسپوروزوایت انگل

تیلریوز بیماری انگلی تک یاخته ای حاد و کشنده ای در گاو است که حاصل عفونت منوسیت و لمفوسیت ها به گونه های مختلف تیلریا می باشد. کنه های هیالوما ناقل این تک یاخته می باشند. تک یاخته تیلریا موجب ترانسفورمه شدن سلول های لکوسیت میزبان شده و این پرولیفراسیون نامحدود بهمراه تخفیف حدت یافته شدن موجب تولید واکسن زنده برعلیه تیلریوز می شود. استفاده از سلول نامیرای حاوی شیزونت تیلریا آنولاتا بر اساس توصیه OIE مهمترین و تنها راه موثر برای پیشگیری از تیلریوز است در این مطالعه با استفاده از تولید سلول ترانسفورمه شده حاصل از عفونت تیلریا در شرایط برون تنی(in vitro)، استفاده از لکوسیت های پاک برای آلودگی بوسیله اسپوروزوایت تیلریا آنولاتا، بررسی و ارزیابی سلول ترانسفورم شده با روش های بیواسی و ملکولی و تهیه رده سلولی جهت استفاده در مطالعات بمنظور بررسی و ارزیابی واکسن مورد نظر بود. گوساله حساس نژاد هلشتاین با خون آلوده به تیلریا آنولاتا با منشا تاکستان قزوین آلودگی تجربی ایجاد شد. کنه ناقل هیالوما با منشا هلاجرد کرج تهیه و در آزمایشگاه پرورش داده شد. لاروهای پاک روی خرگوش بعد از پوست اندازی به نمف های گرسنه تبدیل شدند که روی گوساله آلوده بفرم تجربی خونخواری کرده و بعد از پوست اندازی به بالغین آلوده ای تبدیل شدند که دارای اسپوروزوایت تیلریا بودند کنه های بدست آمده بروش خرد کردن در هاون و سانتریفوژ و فیلتراسیون به استابیلیت آماده تبدیل شدند که برای نگهداری طولانی مدت در انجماد قرار گرفتند. آلودگی کنه های له شده در شرایط درون تنی با تزریق به گوساله حساس پاک و با ایجاد بیماری حاد باثبات رسید ضمن اینکه بوسیله آزمون های آزمایشگاهی مختلف میکروسکپی و ملکولی تمامی مراحل بالا از نظر آلودگی به تیلریا آنولاتا بررسی و تایید گردید. روش رنگ آمیزی متیل گرین پیرونین برای رنگ آمیزی اسیدنوکلوییک و اختصاصا آسینی های آلوده به اسپوروزوایت ها نشان از آلودگی غدد بزاقی کنه های تهیه شده بود. از روشRT-PCRو استفاده از ژن SPAG1 برای اثبات آلودگی استابیلیت ها به اسپوروزوایت فعال کمک گرفته شد. ضمنا ژن های SP و Cytochrome b برای تایید آلودگی به DNA تیلریا استفاده شد. در بررسی درون تنی استابیلیت بدست آمده مشاهده شد که کنه های له شده آلوده به اسپوروزوایت های تیلریا آنولاتا در مقایسه با خون آلوده به سویه حاد تیلریا آنولاتا موجب آلودگی شدید و سریعتر گوساله حساس می شوند. اسپوروزوایت های موجود در استابیلیت کنه (له شده کنه آلوده به تیلریا) در مجاور سلول های تک هسته ای خون محیطی گوساله پاک قرار گرفته و بعد از چند روز تولید رده سلولی آلوده به شیزونت تیلریا مشاهده و سلول حاصل با پاساژهای مکرر بمنظور بررسی میزان بیان ژن های مختلف موثر در ترانسفورماسیون و حدت تک یاخته با روش های ملکولی مورد آزمایش قرار گرفتند. مطالعه بیان ژن های مرتبط با حدت و ترانسفورماسیون سلولی نشان داد که بیان نسبی ژن TGF در پاساژهای مختلف رده سلولی تازه شکل گرفته با افزایش تعداد پاساژ نیز بیشتر می شود در حالیکه بیان نسبی ژن های MMP9 ،Tash HN, AT و Pin1 در پاساژهای مختلفتازه تشکیل شده در پاساژهای اولیه بسیار بالا و با افزایش تعداد پاساژ میزان بیان آن ها کاسته می شود موضوعی که نشان از تاثیر این ژن ها در حدت رده های سلولی داشته که با افزایش تعداد پاساژهای سلولی بیان ژن ها و همزمان حدت آنها نیز کاسته می شود. نتایج مربوط به آنالیز رقابتی برای دو ژن TGF و MMP نیز نتایج نسبی را تایید کرد. این مطالعه با تولید استابیلیت تهیه شده بیش از 600 کنه آلوده به تیلریا زمینه ساز تست کنترلی واکسن تیلریوز بمنظور ارزیابی کارایی واکسن (efficacy, challenge tests) می باشد که در یک تجربه انجام شده نشان داده شد که تزریق استابیلیت تهیه شده موجب مرگ حیوان غیرواکسینه و مقاومت حیوان واکسینه شد. ضمن اینکه تهیه رده سلولی حاصل از مجاور سازی لکوسیت های حیوان پاک در برابر استابیلیت کنه آلوده به تیلریا زمینه ساز تهیه و تولید رده های سلولی مختلفی جهت مطالعه جایگزین رده واکسن در صورت لزوم می باشد.کلمات کلیدی: تیلریا آنولاتا، رده سلولی نامیرا، واکسن، اسپوروزوایت، هیالوما