مطالعه مولکولی و آنالیز بیان ژنهای تعیین کننده رنگ پوششی (پشم ) در گوسفندان بومی ایران

در پژوهش حاضر با هدف شناسایی و جداسازی ژن های موثر بر تمایز و توسعه رنگ پوشش در گوسفندان بومی کشور، 9 فنوتیپ با رنگ های گوناگون مربوط به 3 نژاد زندی، زل و بلوچی انتخاب و پس از تهیه نمونه های بافت پوست و خون، DNA و RNA نمونه ها با روش های استاندارد خالص سازی گردید. جهت شناسایی مسیرهای بیولوژیکی، ژن ها و پروتیین های موثر بر رنگ زایی در پستانداران، با استفاده از منابع اطلاعاتی موجود و مطالعات جامع in Silico، ژن کد کننده گیرنده ملانوکورتین 1 (MC1R) از خانواده G پروتیین ها به عنوان یک ژن کلیدی و موثر انتخاب گردید. این ژن از مهمترین عوامل تنظیمی در مسیر بیوشیمیایی ملانوژنز بوده و بر سنتز رنگدانه درون ملانوسیت ها و نسبت یوملانین به فیوملانین در بسیاری از جانداران اثر گذار است. جهت آنالیز بیان ژن، cDNA نمونه های بافتی با الگو گرفتن از RNA ساخته شده و با روش Semi Quantitative RT-PCR مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد ژن MC1R در فنوتیپ های زندی کبود و زل کبود بیان نسبی داشته و در سایر رنگ های پوشش مورد بررسی از قبیل سیاه یا سفید یکدست، شیری و قهوه ای بیان نمی شود. نواحی کد کننده ژن MC1R پس از طراحی آغازگرهای مناسب، بطور مستقیم از محصولات PCR توالی یابی شد. نتایج تعیین توالی، 8 جایگاه تغییر نوکلیوتیدی در ناحیه اگزونی 978 جفت بازی ژن را نشان داد. یکی از این چندشکلی های نوکلیوتیدی، c.606C> T است که باعث تغییر پروتیینی p.R65W در لوپ داخل سلولی، بین دو دمین ابتدایی پروتیین شده و با ضریب حذفی 93/0 می تواند تا حد زیادی بر ساختار سوم و عملکرد پروتیین اثرگذار باشد. از دیگر تغییرات می توان به c.852CG> GC اشاره نمود که در کلیه نمونه های بومی ایران شناسایی شده و با ایجاد دگرگونی p.R147A در لوپ دوم داخل سلولی پروتیین قابل توجه می باشد. تغییر سوم c.957G> A است که تغییر پروتیینی p.E182K در سومین لوپ خارج سلولی پروتیین MC1R را به دنبال دارد. توالی یابی ناحیه بالادست ژن MC1R به طول 385 جفت باز، منجر به شناسایی 2 جایگاه هتروزیگوت شد که بر اتصال عوامل رونویسی مهمی مانند ADR1 و GAL4 اثر مستقیم دارند. پس از تعیین ژنوتیپ حیوانات به کمک PCR-SSCP در دو ناحیه بالادست و اگزونی ژن MC1R، میزان چندشکلی نوکلیوتیدی در این دو ناحیه از ژن به ترتیب معادل 0017/0 و 002/0 برآورد گردید. بیان ژن فقط در 2 رنگ پوشش خاص، تغییرات شناسایی شده در بالادست ژن و تاثیر احتمالی بر عوامل رونویسی در کنار شناسایی 2 جایگاه چندشکل در ناحیه اگزونی ژن که هر کدام منحصرا در یک فنوتیپ معین یافت شد، تاثیر این ژن کلیدی در بروز تنوع رنگ پوشش دام های بومی ایران را بسیار محتمل می نماید.کلید واژه : گوسفندان بومی ایران، ژن MC1R، فنوتیپ رنگ پوشش، چندشکلی نوکلیوتیدی، آزمون SSCP